Name: healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

Vi takke Ms. LourdesCarreon G Tan for hendes hjælp til vedligeholdelse af medaka anlæg og Anthony Peltier for de illustrative tal. Dette arbejde blev finansieret af NMBU og af Norges forskning-Rådet grant numre 244461 (akvakultur program) og 248828 (Digital Liv Norge program).

Alle dyr håndtering blev udført efter anbefalinger til pleje og dyrevelfærd, forskning på det norske Universitet af biovidenskab og under tilsyn af autoriserede efterforskere.
1. fremstilling af instrumenter og løsninger
Bemærk: Alle løsninger skal være steril. Omhyggelig opmærksomhed bør gives til pH og osmolalitet (osmol/kg vand) af alle løsninger, som bør være nøje tilpasset det ekstracellulære miljø af de undersøgte arter. pH og osmolalitet bør j...

<ol>
	<li>Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+and+signaling+in+the+pituitary+gland.">Ion channels and signaling in the pituitary gland.</a> Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).</li><li>Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+basis+of+pituitary+cell+type-specific+Ca2++signaling-secretion+coupling.">Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling.</a> Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).</li><li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-D2+actions+on+voltage-dependent+calcium+current+and+gonadotropin-II+secretion+in+cultured+goldfish+gonadotrophs.">Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs.</a> J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).</li><li>Chang, J. P., Pemberton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+GnRH-Stimulated+signal+transduction+in+the+vertebrate+pituitary+-+Contributions+from+teleost+model+systems.">Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems.</a> Mol Cell Endocrinol. , (2017).</li><li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+membrane+currents+and+electrophysiological+responses+to+GnRH+in+ovine+gonadotropes.">Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).</li><li>Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+as+a+Prolactin+(PRL)+Inhibitor.">Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor.</a> Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).</li><li>Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GnRH-Induced+[Ca2+]i-signalling+patterns+in+mouse+gonadotrophs+recorded+from+acute+pituitary+slices+in+vitro.">GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro.</a> Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).</li><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Neher, E., Baker, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Techniques in cellular physiology. , 4-19 (1981).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Cahalan, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques:+an+overview.">Patch clamp techniques: an overview.</a> Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).</li><li>Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Channel Recording. , 113-114 (1983).</li><li>Lindau, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE-mediated+degranulation+of+mast+cells+does+not+require+opening+of+ion+channels.">IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels.</a> Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li><li>Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+access+resistance+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B.">Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).</li><li>Fan, J. S., Palade, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforated+patch+recording+with+beta-escin.">Perforated patch recording with beta-escin.</a> Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).</li><li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+primary+culture+of+pituitary+cells+from+the+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).+The+importance+of+osmolality,+pCO(2),+and+pH.">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH.</a> Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).</li><li>Sigworth, F. J., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 3-35 (1983).</li><li>Andersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+slices+-+a+neurobiological+tool+of+increasing+usefulness.">Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness.</a> Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).</li><li>Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+spontaneous+Ca2++transients+in+acute+anterior+pituitary+slices.">Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).</li><li>Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotonic+coupling+in+the+anterior+pituitary+of+a+teleost+fish.">Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish.</a> Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).</li><li>Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+of+the+rat+anterior+pituitary:+morphology,+physiology+and+cell-to-cell+communication.">Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication.</a> J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).</li><li>Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ionic+currents+and+electrophysiological+properties+of+goldfish+somatotropes+in+primary+culture.">Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture.</a> Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).</li><li>Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+ionic+currents+in+goldfish+pituitary+cells.">Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).</li><li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+membrane+properties+and+ionic+currents+in+cultured+goldfish+gonadotrophs.">Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs.</a> Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).</li><li>Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+increases+of+dissociated+tilapia+prolactin+cells+in+response+to+hyposmotic+and+depolarizing+stimuli.">Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli.</a> Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).</li><li>Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+pituitary+cells+in+primary+culture+from+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).</li><li>Strandabo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Hodne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+differences+between+fshb-+and+lhb-expressing+gonadotropes+in+primary+culture.">Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture.</a> Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka--a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).</li><li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes,+amphibians,+and+reptiles.">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pCLAMP+10+Data+Acquisition+and+Analysis+For+Comprehensive+Electrophysiology+User+Guide.">pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide.</a> Molecular Devices Corporation. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiClamp+700B+COMPUTER-CONTROLLED+MICROELECTRODE+AMPLIFIER+Theory+and+Operation.">MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation.</a> Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).</li><li>Dominguez-Mancera, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+regulation+of+inward+membrane+currents,+electrical+activity+and+LH+release+in+isolated+bovine+gonadotropes.">Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).</li><li>Schmidt-Nielsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , 613 (1997).</li><li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+determinants+of+normal+arterial+plasma+pH+in+ectothermic+vertebrates.">Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates.</a> J Exp Biol. 205, 641-650 (2002).</li><li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+normal+arterial+blood+pH+on+sodium+concentration+in+teleost+fish.">The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).</li><li>Heming, T. A., Blumhagen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+acid-base+and+electrolyte+states+of+rainbow+trout+exposed+to+alum+(aluminum+sulphate)+in+acidic+and+alkaline+environments.">Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments.</a> Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).</li><li>Reeves, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+body+temperature+and+acid-base+balance+in+ectothermic+vertebrates.">The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates.</a> Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).</li><li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature:+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency.">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li><li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka,+Oryzias+latipes.">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Lett. 2, 12 (2016).</li><li>Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ion+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B.">The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).</li><li>Holz, R., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water+and+nonelectrolyte+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B.">The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).</li></ol>

Elektrofysiologiske optagelser ved hjælp af patch-clamp-teknik på hjernen-hypofyse skiver kræver omhyggelig optimering. Godt optimeret protokoller live-celle kontrolundersoegelser specifikt i teleosts er begrænset, med fleste af publikationer ved hjælp af protokoller baseret på pattedyr systemer. I denne forbindelse er det vigtigt at være opmærksom på, at flere fysiologiske parametre som pH og osmolalitet er ikke kun arter afhængige, men også meget afhængig hvorvidt den pågældende organisme lever på land e...

Hypofysen er en vigtige endokrine orgel i hvirveldyr placeret under hypothalamus og posteriort for den optiske chiasm. Det producerer og udskiller seks til otte hormoner fra de specifikke celletyper. Hypofyse hormoner udgør en mellemting mellem hjernen og perifere organer og køre en lang række væsentlige fysiologiske processer, herunder vækst, reproduktion og reguleringen af homeostase. Svarende til neuroner, endokrine celler af hypofysen er elektrisk overgearet med evnen til at fyre handling potentialer spontant 1. Rollen, som disse handling potentialer er celle afhængige. I flere celletyper af pattedyr hypofysen, kan handling potentialer løfte den intracellulære Ca2 + tilstrækkeligt til en vedvarende frigivelse af hormonet 2. Derudover modtager hypofysen både stimulerende og hæmmende oplysninger fra hjernen, der påvirker membranen potentiale celler 3,4,5,6. Typisk, stimulerende input øger ophidselse og ofte indebærer frigivelsen af Ca2 + fra intracellulære butikker samt øget fyring frekvens 7. Forstå, hvordan cellen udnytter ion-kanal sammensætning og tilpasser sig disse input signaler fra hjernen er nøglen til forståelse hormon syntese og frigivelse.
Patch-clamp-teknik blev udviklet i slutningen af 1970 ' erne af Sakmann og Neher 8,9,10 og yderligere forbedret ved Hamill 11, og giver mulighed for detaljerede undersøgelser af elektrofysiologiske egenskaber af celler ned til enkelt Ionkanaler. Teknikken kan desuden bruges til at studere både strøm og spænding. I dag, er patch-fastspænding guld standard for måling af elektrofysiologiske egenskaber af cellen. Fire store konfigurationer af tæt forsegling patch-clamp-teknik har været udviklede 11; celle-attached, indefra og ud, udenfor-out og hele-cell-patch. De tre første konfigurationer bruges typisk til enkelt ion-kanal undersøgelser. For det fjerde, efter den celle-attached konfiguration, er et hul i cellemembranen lavet ved hjælp af sub atmosfærisk tryk. Denne konfiguration giver også mulighed for undersøgelser af ion-kanal sammensætning af hele cellen 12. En begrænsning af denne teknik er imidlertid at cytoplasmatisk molekyler udvandes af den patch pipette løsning 13 (fig. 1A), hvilket påvirker de elektriske og fysiologiske reaktioner i de undersøgte celler. Faktisk, nogle af disse molekyler kan spille en vigtig rolle i transduktion af signalet eller regulering af forskellige Ionkanaler. For at undgå dette, udviklet Lindau og Fernandez 14 en metode, hvor en poreformede sammensatte føjes til patch pipette. Efter den celle-attached konfiguration, vil sammensat indarbejde i plasma membranen under patch og langsomt perforere membran skabe elektrisk kontakt med cytosol (figur 1B). Flere forskellige svampemidler såsom nystatin 15 og amphotericin B 16eller overfladeaktive stoffer såsom saponin beta-escin 17,18 kan bruges. Disse forbindelser oprette porer stor nok til at tillade monovalent kationer og Cl- diffusion mellem cytosol og patch pipette samtidig bevare de cytosole niveauer af makromolekyler og større ioner som Ca2 + 15, 16.
Udfordringen ved hjælp af perforeret patch er potentielt høje serie modstand. Serien modstand (Rs) eller adgang modstand er den samlede modstand over patch pipette i forhold til jorden. Under patch-clamp optagelser, Rasmussens vil være parallelt med membran modstand (Rm). Rm og Rs i sideløbende arbejde som en spænding skillevæg. Med høj Rasmussens, vil spændingen falder over Rs give fejl i optagelserne. Fejlen vil blive større med større strømme registreres. Spænding skillevæg er derudover også frekvens afhænger af, at skabe en lav-pass filter, således påvirke den tidsmæssige opløsning. I realiteten kan den perforerede patch ikke altid muligt at optagelser af store og hurtige strømninger som spændingen gated Na+ strømme (for detaljeret aflæsninger Se reference 19). Også, Rasmussens kan variere under patch-clamp optagelser, igen fører til ændringer i den registrerede aktuelle. Således er kan falske positiver opstå i situationer hvor Rs ændringer under stof ansøgning.
Elektrofysiologi på skiver væv blev introduceret af Andersen lab at studere elektrofysiologiske egenskaber af neuroner i hjernen 20. Teknikken, der banede vejen for detaljerede undersøgelser af enkelt celler samt celle-celle kommunikation og celle kredsløb i en mere intakt miljø. En lignende teknik til at gøre hypofyse skiver blev indført i 1998 af Guérineau et al. 21. det var dog ikke før 2005, at hjernen-hypofyse skive forberedelse blev brugt med succes til patch-clamp undersøgelser i teleost 22. I denne undersøgelse rapporterede forfatterne også brugen af perforeret patch-clamp optagelser. Men langt de fleste af de elektrofysiologiske undersøgelser af hypofyse celler er blevet ført i pattedyr, og kun en håndfuld andre hvirveldyr, herunder teleost fisk 1,2,22,23 . I teleosts, blev næsten alle undersøgelser udført på primære dissocierede celler 24,25,26,27,28,29,30 .
I det foreliggende papir skitsere vi en optimeret protokol for forberedelse af sund hjerne-hypofyse skiver fra model fisk medaka. Metoden repræsenterer flere fordele i forhold til primære dissocierede cellekulturer. Først, registreres cellerne i et relativt konserveret miljø i forhold til dissocieres celle kultur betingelser. Andet, Skive præparater tillade os at studere indirekte veje medieret af celle-celle kommunikation 22, som er ikke muligt i dissocierede celle kultur betingelser. Desuden demonstrere vi, hvordan man gennemføre elektrofysiologiske optagelser på de opnåede væv skiver med perforeret hele-celle patch-clamp-teknik med amphotericin B som poreformede agent.
Medaka er en lille ferskvandsfisk native til Asien, især findes i Japan. Fysiologi, embryologi og genetik af medaka er blevet grundigt undersøgt for over 100 år 31, og det er et almindeligt anvendt forskning model i mange laboratorier. Af særlig betydning for dette dokument er de forskellige morfologiske organisation af hypothalamus-hypofyse-kompleks i teleost fisk: boer i pattedyr og fugle af hypothalamus neuroner frigive deres neuro-hormoner regulerer hypofysens endokrine celler ind i den portal systemet af medianen eminence er der en direkte nervøs projektion af hypothalamus neuroner på de endokrine celler af hypofysen i teleost fisk 32. Således er nøje gennemført hjerne-hypofyse udskæring af særlig betydning i fisk, så vi kan undersøge elektrofysiologiske egenskaber af hypofyse cellerne i et velbevaret hjerne-hypofyse-netværk, og især hvordan hypofyse celler styre deres ophidselse og dermed Ca2 + homøostase.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Vibratome</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:157px;">VT1000 S</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Chirurgical glue</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td>VETBOND</td>
			<td style="width:428px;">3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Stainless steel blades</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>752-1-SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">metal molds</td>
			<td style="width:171px;">SAKURA</td>
			<td style="width:157px;">4122</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">steel harp</td>
			<td style="width:171px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:157px;">64-1417</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">PBS</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">D8537</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultrapure LMP agarose</td>
			<td style="width:171px;">invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">166520-100</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:309px;">patch pipettes</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF150-110-10HP</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Microscope Slicescope</td>
			<td style="width:171px;">Scientifica</td>
			<td style="width:157px;">pro6000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">P-Clamp10</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">#1-2500-0180</td>
			<td style="width:428px;">sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Digitizer Digidata 1550A1</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">DD1550</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">1-CV-7B</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">GnRH</td>
			<td style="width:171px;">Bachem</td>
			<td style="width:157px;">4108604</td>
			<td style="width:428px;">H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">P-1000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">amphotericin B</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A9528</td>
			<td style="width:428px;">pore-forming antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyethylenimine&#160;</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">P3143</td>
			<td style="width:428px;">50% PEI solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microfiler syringe</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td style="width:157px;">MF28/g67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">glass for the agar bridge</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF200-116-15</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Manager software</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:428px;">Open Source Microscopy Software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">optiMOS sCMOS camera</td>
			<td style="width:171px;">Qimaging</td>
			<td style="width:157px;">&#160;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">sonicator</td>
			<td style="width:171px;">Elma</td>
			<td style="width:157px;">D-7700 singen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MgCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hepes</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">CaCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-mannitol</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">63565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MES-acid</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">M0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">BSA</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

Elektrofysiologiske undersøgelser af hypofyse celler er blevet gennemført i adskillige vertebrater, men meget få i teleost fisk. Blandt disse er blevet udført et klart flertal på dissocierede primærelementer. For at forbedre vores forståelse af hvordan teleost hypofyse celler, opfører sig i en mere biologisk relevante miljø, viser denne protokol Sådan Forbered levedygtige hjerne-hypofyse skiver ved hjælp af små ferskvandsfisk medaka (Oryzias latipes). Gør hjernen-hypofyse skiver, blev pH og osmolalitet af alle løsninger justeret til værdier fundet i kropsvæsker ferskvands fisk lever ved 25-28 ° C. Efter skive forberedelse viser protokollen hvordan man fører elektrofysiologiske optagelser ved hjælp af perforeret hele-celle patch-clamp-teknik. Patch-clamp-teknik er et kraftfuldt værktøj med hidtil uset tidsmæssige opløsning og følsomhed, giver mulighed for undersøgelse af elektriske egenskaber fra intakt hele celler ned til enkelt Ionkanaler. Perforeret patch er enestående i, at det holder den intracellulære miljø intakt forhindrer regulerende elementer i cytosol i bliver fortyndet af patch pipette elektrode løsning. Derimod når du udfører traditionelle hele-celle optagelser, blev det observeret, at medaka hypofyse celler hurtigt mister deres evne til at fyre handling potentialer. Blandt de forskellige perforering teknikker til rådighed demonstrerer denne protokol hvordan man kan opnå perforation af lappet membranen ved hjælp af fungicid Amphotericin B.

Denne protokol viser en trin for trin protokol om, hvordan man opnå pålidelige elektrofysiologiske optagelser fra hypofysen (gonadotrope) celler, ved hjælp af en medaka transgene linje [Tg (lhb- hrGfpII)] hvor målet celler (Lh-producerende gonadotropes) er mærket med grønne fluorescerende proteiner (NGL).
I første omgang, blev de elektrofysiologiske undersøgelser gennemført ved hjælp af hele-celle konfiguratio...

Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Artiklen beskriver en optimeret protokol for at gøre levedygtige hjerne-hypofyse væv skiver, ved hjælp af teleost fisk medaka (Oryzias latipes), efterfulgt af elektrofysiologiske optagelser af hypofyse celler ved hjælp af patch-clamp-teknik med den perforeret patch configuration.

Sund hjerne-hypofyse skiver for elektrofysiologiske undersøgelser af hypofyse celler i Teleost fisk

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In Vivo Elektrofysiologiske Målinger på Mouse iskiasnerver

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Forbundne Helcelle optagelser i Organotypiske hippocampusskiver

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrofysiologiske og morfologiske karakterisering af neuronal Mikrokredsløb i akut Brain Skiver Brug parrede Patch-clamp optagelser

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Dissektion af Frygt Kredsløb i Brain Skiver

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Udarbejdelse af horisontale Skiver af Voksen Mouse Retina for Elektrofysiologiske Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

Elektrofysiologiske undersøgelser af Retinogeniculate og Kortikogeniculate synapse funktion

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering af langvarig depression induktion i voksne cerebellar skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...