Name: healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

Wir danken Frau LourdesCarreon G Tan für ihre Hilfe, die Aufrechterhaltung der Medaka Anlage und Anthony Peltier für die anschaulichen Zahlen. Diese Arbeit wurde von NMBU und der Forschung Rat von Norwegen, Grantnummern 244461 (Aquakultur-Programm) und 248828 (Digitalleben Norwegen-Programm) finanziert.

Alle Tier Handhabung wurde entsprechend den Empfehlungen für die Pflege und das Wohlergehen der Versuchstiere an der Norwegian University Life Sciences und unter der Aufsicht der autorisierte Ermittler durchgeführt.
1. Vorbereitung der Instrumente und Lösungen
Hinweis: Alle Lösungen sollten steril sein. Sorgfältige Augenmerk auf den pH-Wert und die Osmolalität (Osmol/kg Wasser) aller Lösungen, die sorgfältig die extrazellulären Umwelt der untersuchten Arten a...

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Elektrophysiologische Aufnahmen mit der Patch-Clamp-Technik auf Gehirn-Hypophysen Scheiben benötigen sorgfältige Optimierung. Gut optimierte Protokolle für Leben-Zelle Untersuchungen insbesondere umkonstruiert beschränken sich die meisten Publikationen mit Protokollen auf Basis von Säugetier-Systemen. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Tatsache, dass mehrere physiologische Parameter wie pH-Wert und Osmolalität kennen nicht nur Arten angewiesen, aber auch sehr stark abhängig ob der betreffende Organismus le...

Die Hypophyse ist ein wichtiger endokrine Organ bei Wirbeltieren unterhalb des Hypothalamus und posterior, die Optik Chiasmus. Es produziert und sondert sechs bis acht Hormone aus der spezifischen Zelltypen. Hypophyse Hormone bilden ein Zwischenprodukt zwischen Gehirn und periphere Organe und fahren zahlreiche essentielle physiologische Prozesse einschließlich Wachstum, Fortpflanzung und Regelung der Homöostase. Ähnlich wie bei Neuronen, endokrinen Zellen der Hypophyse sind elektrisch erregbare mit der Fähigkeit, spontan Aktionspotentiale abzufeuern 1. Die Rolle der diese Aktionspotentiale ist Zelle angewiesen. In verschiedenen Zelltypen der Säugetier-Hypophyse können Aktionspotentiale der intrazellulären Ca2 + ausreichend für ein verzögerter Freisetzung des Hormons 2erheben. Darüber hinaus erhält die Hypophyse stimulierende und hemmende Informationen aus dem Gehirn, das das Membrane Potential der Zellen 3,4,5,6betrifft. In der Regel stimulierende Eingang erhöht die Erregbarkeit und oft beinhaltet die Freisetzung von Ca2 + von intrazellulären speichern sowie erhöhte Frequenz 7feuern. Verstehen, wie die Zelle nutzt die Ionen-Kanal-Komposition und passt sich diese Signale aus dem Gehirn ist Schlüssel zum Verständnis der hormonsynthese und Freigabe.
Die Patch-Clamp-Technik wurde in den späten 1970er Jahren von Sakmann und Neher 8,9,10 entwickelt und weiter verbessert, indem Hamill 11, und ermöglicht detaillierte Untersuchungen der elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Darüber hinaus kann die Technik verwendet werden, für das Studium von Strom und Spannung. Patch-Klemmung ist heute der Goldstandard für die Messung von elektrophysiologischer Eigenschaften der Zelle. Vier wichtige Konfigurationen von dicht-Patch-Clamp-Technik wurden entwickelten 11; der Zelle angebracht, Inside-Out, die außen-Out und die gesamte Zelle Patch. Die drei ersten Konfigurationen sind in der Regel für einzelne Ionen-Kanal Untersuchungen verwendet. Für die vierte, von der Zelle-attached Konfiguration wird ein Loch in der Zellmembran mit Sub-atmosphärischen Druck hergestellt. Diese Konfiguration ermöglicht auch Untersuchungen der Ionen-Kanal Zusammensetzung der ganzen Zelle 12. Eine Einschränkung dieser Technik ist jedoch, dass zytoplasmatischen Moleküle durch den Patch Pipette Lösung 13 (Abb. 1A), was sich auf die elektrische und physiologischen Reaktionen der untersuchten Zellen verdünnt werden. In der Tat können einige von diesen Molekülen eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion des Signals oder bei der Regulierung der verschiedenen Ionenkanäle spielen. Um dies zu vermeiden, Lindau und Fernandez 14 eine Methode entwickelt, wo eine Pore-forming Verbindung zu den Patch-Pipette hinzugefügt. Im Anschluss an die Zelle-attached Konfiguration wird die Verbindung in der Plasmamembran unter den Patch integrieren und langsam Perforieren die Membran Erstellung elektrischen Kontakt mit dem Zytosol (Abbildung 1B). Mehrere verschiedene Antimykotika wie Nystatin 15 und Amphotericin B 16oder Tenside wie Saponin Beta-Aescin 17,18 können verwendet werden. Diese Verbindungen erstellen Poren groß genug, um monovalente kationen und Cl– Diffusion zwischen dem Cytosol und die Patch-Pipette unter Beibehaltung der cytosolischen Ebenen von Makromolekülen und größeren Ionen wie Ca2 + 15zu ermöglichen, 16.
Die Herausforderung der Verwendung von perforierten Patch ist der potenziell hohen Reihenwiderstand. Vorwiderstand (R-s) oder Zugang Widerstand ist der Gesamtwiderstand über die Patch-Pipette im Verhältnis zum Boden. Während Patch-Clamp-Aufnahmen, die R-s werden parallel mit Membran-Widerstand (Rm). Rm und Rs in Parallele Arbeit als Spannungsteiler. Mit dem hohen R-s, fällt die Spannung über die R-s geben Fehler in den Aufnahmen. Der Fehler wird mit größeren Strömungen erfasst größer geworden. Darüber hinaus ist der Spannungsteiler auch frequenzabhängig einen Tiefpass-Filter, was sich auf die zeitliche Auflösung zu schaffen. In der Tat kann der perforierten Patch nicht immer zulassen Aufnahmen von großen und schnellen Strömungen wie die Spannung Na+ Strömungen Gated (für detaillierte Messwerte Referenz 19 Siehe) Rs kann auch während der Patch-Clamp-Aufnahmen, wieder führt zu Veränderungen in den aufgenommenen Strom variieren. So können Fehlalarme in Situationen auftreten wo Rs während der Zulassungsantrag ändert.
Die Elektrophysiologie auf das geschnittene Gewebe wurde erstmals von Andersen-Lab, elektrophysiologische Eigenschaften der Nervenzellen im Gehirn 20zu studieren. Die Technik ebnete den Weg für detaillierte Untersuchungen der Einzelzellen sowie Zellezelle Kommunikation und Zelle Schaltungen in einem mehr intakten Umwelt. Eine ähnliche Technik für die Herstellung von Hypophyse Scheiben wurde von Guérineau Et Al. 1998 eingeführt. 21. es war jedoch nicht vor 2005 wurde dieser Gehirn-Hypophysen Slice-Vorbereitung für Patch-Clamp-Studien in teleost 22erfolgreich eingesetzt. In dieser Studie berichteten die Autoren auch die Verwendung von perforierten Patch-Clamp-Aufnahmen. Allerdings wurden bei weitem die meisten elektrophysiologischen Untersuchungen der Hypophysen Zellen bei Säugetieren, und nur eine Handvoll anderer Wirbeltiere, einschließlich teleost Fische 1,2,22,23 durchgeführt . Im umkonstruiert wurden fast alle Studien am primären dissoziierten Zellen 24,25,26,27,28,29,30 durchgeführt. .
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Zubereitung von gesunden Gehirn-Hypophysen-Scheiben aus dem Modell Fisch Medaka. Der Ansatz stellt mehrere Vorteile im Vergleich zu primären dissoziierten Zellkulturen. Zuerst werden die Zellen in einer relativ geschützten Umgebung im Vergleich zu Zelle Kulturbedingungen getrennt erfasst. Zweitens erlauben Slice Vorbereitungen uns indirekte Wege vermittelt durch Zell-Zell-Kommunikation- 22, das ist nicht möglich in dissoziierten Zelle Kulturbedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus führen wir elektrophysiologische Aufnahmen auf die erhaltenen Gewebe-Scheiben mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik mit Amphotericin B als die porenbildner durchzuführen.
Medaka ist eine kleine Süßwasserfische aus Asien, vor allem in Japan gefunden. Physiologie, Embryologie und Genetik von Medaka wurden für mehr als 100 Jahren 31ausgiebig untersucht, und es ist eine häufig verwendete Forschungsmodell in vielen Laboratorien. Für dieses Papier von besonderer Bedeutung ist die deutliche morphologische Organisation der Hypothalamus-Hypophysen-Komplex in teleost Fische: während in Säugetiere und Vögel der Hypothalamus Neuronen ihre Neuro-Hormone regulieren Hypophyse endokrine Zellen freigeben in das Portal die mediane Eminenz ist eine direkte nervöse Projektion des Hypothalamus Neuronen auf die endokrinen Zellen der Hypophyse in teleost Fische 32. Deshalb sorgfältig durchgeführte Gehirn-Hypophysen Schneiden von besonderer Bedeutung in Fisch, ermöglicht es uns, elektrophysiologische Eigenschaften der Hypophysen Zellen in einem gut erhaltenen Gehirn-Hypophysen-Netzwerk und insbesondere wie Hypophysen Zellen untersuchen Steuern Sie ihre Erregbarkeit und damit Ca2 + Homöostase.

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		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Vibratome</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:157px;">VT1000 S</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Chirurgical glue</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td>VETBOND</td>
			<td style="width:428px;">3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Stainless steel blades</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>752-1-SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">metal molds</td>
			<td style="width:171px;">SAKURA</td>
			<td style="width:157px;">4122</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">steel harp</td>
			<td style="width:171px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:157px;">64-1417</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">PBS</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">D8537</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultrapure LMP agarose</td>
			<td style="width:171px;">invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">166520-100</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:309px;">patch pipettes</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF150-110-10HP</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Microscope Slicescope</td>
			<td style="width:171px;">Scientifica</td>
			<td style="width:157px;">pro6000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">P-Clamp10</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">#1-2500-0180</td>
			<td style="width:428px;">sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Digitizer Digidata 1550A1</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">DD1550</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">1-CV-7B</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">GnRH</td>
			<td style="width:171px;">Bachem</td>
			<td style="width:157px;">4108604</td>
			<td style="width:428px;">H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">P-1000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">amphotericin B</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A9528</td>
			<td style="width:428px;">pore-forming antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyethylenimine&#160;</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">P3143</td>
			<td style="width:428px;">50% PEI solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microfiler syringe</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td style="width:157px;">MF28/g67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">glass for the agar bridge</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF200-116-15</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Manager software</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:428px;">Open Source Microscopy Software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">optiMOS sCMOS camera</td>
			<td style="width:171px;">Qimaging</td>
			<td style="width:157px;">&#160;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">sonicator</td>
			<td style="width:171px;">Elma</td>
			<td style="width:157px;">D-7700 singen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MgCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hepes</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">CaCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-mannitol</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">63565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MES-acid</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">M0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">BSA</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen wurden in zahlreichen Wirbeltierarten, aber nur sehr wenige in den teleost Fischen durchgeführt. Unter diesen sind die klare Mehrheit an dissoziierten Primärzellen durchgeführt worden. Um zu einem besseren Verständnis der wie teleost Hypophysen Zellen, in einem mehr biologisch relevante Umfeld Verhalten, veranschaulicht dieses Protokolls lebensfähige Gehirn-Hypophysen-Scheiben mit kleinen Süßwasserfische Medaka (Oryzias Latipes) vorzubereiten. Machen die Gehirn-Hypophysen-Scheiben, wurden pH-Wert und Osmolalität aller Lösungen auf Werte in Körperflüssigkeiten von Süßwasserfischen Leben bei 25 bis 28 ° c eingestellt Nach Vorbereitung der Scheibe veranschaulicht das Protokoll führen elektrophysiologische Aufnahmen mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik. Die Patch-Clamp-Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit noch nie da gewesenen zeitlicher Auflösung und Empfindlichkeit, so dass die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von intakten ganze Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Perforierten Patch ist einzigartig, da es hält die intrazelluläre Umwelt intakt zu verhindern, dass sich regulatorische Elemente in das Zytosol durch die Patch-Pipette-Elektrode-Lösung verdünnt wird. Im Gegensatz dazu wurde bei der gesamten Zelle Bauform es beobachtet, dass Medaka Hypophysen Zellen schnell ihre Fähigkeit verlieren, Aktionspotentiale abzufeuern. Unter den verschiedenen Perforation-Techniken veranschaulicht dieses Protokoll zu Perforation der gepatchten Membran mit Fungizid Amphotericin b.

Dieses Protokoll zeigt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll wie zuverlässige elektrophysiologische Aufnahmen aus Zellen der Hypophyse (Gonadotrope), mit einer Medaka transgene Linie [Tg (Lhb- HrGfpII)], wo Zellen das Ziel (Gonadotropine Lh-Produktion) mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) beschriftet sind.
Zunächst wurden die elektrophysiologischen Untersuchungen mit ganz-Zell Konfiguration durchgeführt. Jedoch wur...

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Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Der Artikel beschreibt eine optimierte Protokoll für machen lebensfähigen Gehirn-Hypophysen Gewebe Scheiben schneiden, mit den teleost Fische Medaka (Oryzias Latipes), gefolgt von elektrophysiologischen Aufzeichnungen von Hypophysen Zellen mithilfe der Patch-Clamp-Technik mit der perforierten Patch Konfiguration.

Gesundes Gehirn-Hypophysen-Scheiben für Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen in Teleost Fische

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Riesen-Fiber Pathway der D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

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Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In-vivo-Elektrophysiologische Messungen an Maus Ischiasnerven

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

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Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

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Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion

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Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

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