Name: healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00
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LourdesCarreon G タンさんのめだかの施設を維持する助けと例示図のアンソニー ・ ペルチェに感謝しますこの作品は、NMBU、許可番号 244461 (養殖プログラム) と 248828 (デジタル ライフ ノルウェー プログラム)、ノルウェーの研究協議会に賄われていた。

生命科学研究科の承認された調査官の監督の下でケアとノルウェーの大学での研究の動物の福祉のための推奨事項に従ってすべて動物取扱を行った。
1. 機器およびソリューションの準備
注: すべてのソリューションは、無菌でなければなりません。細心の注意は、pH と慎重に学びの種の細胞外の環境に適応する必要がありますすべてのソリューション...

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	<li>Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+and+signaling+in+the+pituitary+gland.">Ion channels and signaling in the pituitary gland.</a> Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).</li><li>Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+basis+of+pituitary+cell+type-specific+Ca2++signaling-secretion+coupling.">Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling.</a> Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).</li><li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. 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脳下垂体スライスのパッチ ・ クランプの技術を使用して電気生理学的記録は、慎重に最適化を必要とします。特に硬骨魚類における生細胞調査のためよく最適化されたプロトコルは哺乳類システムに基づくプロトコルを使用して、文書の大半と限られます。この点で、それは重要な pH および浸透圧のようないくつかの生理学的パラメーターの事実を知っている種だけでなく扶養家族、しか?...

下垂体は視床下部の下に位置し、視交叉の後方、脊椎動物の主要内分泌器官です。生成され、特定の細胞型から 6 ~ 8 ホルモンを分泌します。下垂体ホルモン脳と末梢器官との間の中間体を構成し、成長、生殖、恒常性の調節など重要な生理学的なプロセスの広い範囲をドライブします。神経細胞、下垂体の内分泌細胞と同様、自発的に活動電位を発生させる能力を持つ電気的興奮性1。これらの活動電位の役割は、細胞依存性です。哺乳類の下垂体のいくつかのセルの種類、活動電位を昇格できます、細胞内 Ca2 +ホルモン2の持続的なリリースを十分に。また、下垂体は、脳細胞の3,4,5,6の膜電位に影響を与えるから促進と抑制の両方の情報を受け取ります。通常、刺激入力興奮性を増加、しばしば細胞内ストアからの Ca2 +の放出を含むと同様発射周波数7増加します。どのようにセルがイオン チャネル構成を利用し、脳からこれらの入力信号に適応を理解理解ホルモンの合成と放出の鍵です。
パッチ ・ クランプの技術により開発され 1970 年代後半ザックマンと Neher 8,9,10 、 11・ ハミル、さらに向上でき、細胞の電気生理学的特性の調査下の単一イオン チャネル。また、電流と電圧の両方の研究の手法を使用できます。今日、パッチ クランプは、細胞の電気生理学的特性の測定のゴールド スタンダードです。タイトなシールのパッチ ・ クランプの技術の 4 つの主要な構成はずっと先進11;セル付、インサイド アウト、外アウト、全細胞のパッチ。3 つの最初の構成は通常、単一イオン チャネルの調査のため使用されます。次のセル接続構成では、4 番目の細胞膜の穴は、減圧を使用して行われます。この構成には、 12セル全体のイオン チャネル構成の調査もできます。しかし、この手法の 1 つの制限は細胞質分子希釈パッチ ピペット ソリューション13 (図 1A)、研究の細胞の電気的および生理学的反応に影響を与えることです。確かに、信号の伝達や異なったイオン チャネルの規制重要な役割を再生可能性がありますそれらの分子のいくつか。これを避けるには、リンダウとフェルナンデス14パッチ ピペットに細孔形成化合物を追加する位置方法を開発しました。セル接続構成では、次の化合物はパッチの下の膜に組み込む、ゆっくりと細胞質 (図 1B) と電気的接触を作成する膜を穿孔します。ナイスタチン15とアムホテリシン B 16などいくつかの異なる抗真菌薬または界面活性剤サポニン β エスシン17,18などを使用できます。これらの化合物は一価の陽イオンと Cl-高分子と Ca2 + 15のようなより大きいイオンのゾル性細胞質のレベルを維持しながら細胞質とパッチ ピペットの拡散を許可するのに十分な大きさの毛穴を作成します。 16。
穴あきのパッチを使用しての課題は、潜在的に高い直列抵抗です。直列抵抗 (Rs) またはアクセス抵抗合成抵抗を地面に関連してパッチ ピペット上です。パッチ ・ クランプ記録中に膜の抵抗と並列に Rsになります (Rm)。Rmと Rs電圧ディバイダーとして並列処理で。高 Rs Rsの録音にエラーを与える倒れる電圧。エラーは記録された大きな電流と大きくなります。さらに、電圧ディバイダーはまた周波数依存の時間分解能に影響を与える低域通過フィルターの作成です。事実上、穿孔パッチできないがあります常に大きい高速な電流の録音 (詳細な測定値は、参照19を参照) ために、電圧ゲートの Na+電流のような。また、Rsは、パッチ ・ クランプ記録、記録された電流の変化に再びリード中に異なる場合があります。したがって、偽陽性は、Rsが薬剤の適用時に変更の状況で発生します。
スライスした組織に電気生理学は20の脳における神経細胞の電気生理学的特性を研究するアンデルセン研究室で初めて導入されました。技術よりそのままの環境で細胞間コミュニケーションとセル回路と同様に、単一のセルの詳細な調査のための道を開いた。下垂体のスライスを作るため同様の手法は、Guérineauらによって 1998 年に導入されました。21します。 しかし、それはなかった 2005 年前に、その脳下垂体スライス標本が魚類22のパッチ ・ クランプ学正常に使用されました。本研究で著者らはまた穿孔パッチ ・ クランプ記録の使用を報告しました。しかし、はるかに、下垂体細胞の電気生理学的調査のほとんどで行われている、哺乳類、魚類1,2,22,23 を含む他の脊椎動物のほんの一握り.真骨魚類、一次解離細胞24,25,26,27,28,29,30 ほぼすべての研究を行った.
本論文ではモデルのメダカから健康な脳下垂体スライスの準備のための最適化されたプロトコルの概要を説明します。アプローチは、一次解離細胞培養に比べていくつかの利点を表します。まず、細胞が解離細胞の培養条件と比較して比較的保存状態の良い環境で記録されます。第二に、スライス標本は解離細胞の培養条件で不可能である細胞間コミュニケーション22を介した間接的な経路を研究することを許可します。さらに、孔形成剤としてアムホテリシン B と穴あき細胞パッチ ・ クランプの技術を使用して得られた組織スライスの電気生理学的記録を行う方法を示します。
メダカは小さな淡水魚の原産アジア、主に日本で発見です。それは多くの実験室で一般的に使用される研究モデルや生理学、発生学、メダカの遺伝学は広く以上 100 年31、検討されています。この紙に特に重要なの魚類に視床下部-下垂体複合体の個別の形態学的組織: 哺乳類や鳥類に視床下部ニューロン解放の神経ホルモンの下垂体の内分泌細胞を調節するのに対し正中隆起のポータル ・ システムに硬骨魚32で下垂体の内分泌細胞に視床下部ニューロンの直接神経投射があります。したがって、魚、特にどのように下垂体細胞とよく保存された脳下垂体ネットワークの下垂体細胞の電気生理学的特性を調査することで特に重要なは、慎重に行った脳下垂体スライス興奮性を制御し、それによって Ca2 +恒常性。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
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		<col />
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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Vibratome</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:157px;">VT1000 S</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Chirurgical glue</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td>VETBOND</td>
			<td style="width:428px;">3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Stainless steel blades</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>752-1-SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">metal molds</td>
			<td style="width:171px;">SAKURA</td>
			<td style="width:157px;">4122</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">steel harp</td>
			<td style="width:171px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:157px;">64-1417</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">PBS</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">D8537</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultrapure LMP agarose</td>
			<td style="width:171px;">invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">166520-100</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:309px;">patch pipettes</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF150-110-10HP</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Microscope Slicescope</td>
			<td style="width:171px;">Scientifica</td>
			<td style="width:157px;">pro6000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">P-Clamp10</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">#1-2500-0180</td>
			<td style="width:428px;">sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Digitizer Digidata 1550A1</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">DD1550</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">1-CV-7B</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">GnRH</td>
			<td style="width:171px;">Bachem</td>
			<td style="width:157px;">4108604</td>
			<td style="width:428px;">H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">P-1000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">amphotericin B</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A9528</td>
			<td style="width:428px;">pore-forming antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyethylenimine&#160;</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">P3143</td>
			<td style="width:428px;">50% PEI solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microfiler syringe</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td style="width:157px;">MF28/g67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">glass for the agar bridge</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF200-116-15</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Manager software</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:428px;">Open Source Microscopy Software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">optiMOS sCMOS camera</td>
			<td style="width:171px;">Qimaging</td>
			<td style="width:157px;">&#160;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">sonicator</td>
			<td style="width:171px;">Elma</td>
			<td style="width:157px;">D-7700 singen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MgCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hepes</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">CaCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-mannitol</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">63565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MES-acid</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">M0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">BSA</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

下垂体細胞の電気生理学的調査は、多くの脊椎動物でも魚類に非常にいくつか行われています。これらのうち、過半数は解離の主細胞で行われています。どの硬骨魚の下垂体細胞の私達の理解を改善より生物学的関連性の高い環境での動作は、このプロトコルは、小さな淡水魚メダカ (メダカ) を使用して実行可能な脳下垂体スライスを準備する方法を示します。値 25 に 28 ° C で住んでいる淡水魚の体液の pH および浸透圧のすべてのソリューションの脳下垂体スライスを作り、調整されました。次のスライス標本は、プロトコルは、穴あき細胞パッチク ランプ法を用いた電気生理学的録音を実施する方法を示します。パッチ ・ クランプの技術は、前例のない時間分解能と感度、単一イオン チャネルにそのまま全体のセルからの電気的特性の調査を許可する強力なツールです。それはそのままパッチ ピペット電極溶液で希釈されてから細胞質の規制要素を防止する細胞内の環境を保つユニーク穿孔パッチです。対照的に、伝統的な全細胞記録を実行すると、めだかの下垂体細胞が迅速に活動電位を発生させる能力を失うことが観察されました。様々 な穿孔技術を利用可能な中でこのプロトコルは殺菌剤のアムホテリシン b. を使用してパッチを適用した膜の穿孔を実現する方法を示します

このプロトコルはターゲット細胞の (Lh 生産アクチビン) めだか形質転換線 [Tg (1塩基変異hrGfpII)] を使用して、下垂体 (gonadotrope) セルから信頼性の高い記録を達成する方法のステップ バイ ステップ プロトコルを示します緑色蛍光タンパク質 (GFP) が付いています。
当初は、全細胞の構成を使用して電気生理学的調査?...

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Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

続いて硬骨魚メダカ (メダカ) を使用して実行可能な脳下垂体組織スライスを作るとパッチ ・ クランプの技術を用いた下垂体細胞の電気生理学的記録のために、最適化されたプロトコルを説明、穴あきのパッチ構成。

魚類に下垂体細胞の電気生理学的調査のための健康的な脳下垂体スライス

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

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の巨大線維経路からの電気生理学的記録 D.キイロ</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

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無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

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In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

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マウス坐骨神経に生体内電気生理学的測定値の

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Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

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急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

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Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

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電気生理学的研究のための成体マウスの網膜の水平スライスの調製

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