Name: healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

우리 양 LourdesCarreon G 탄 메 다카 시설을 유지 하는 그녀의 도움 및 안토니 Peltier 설명 그림에 대 한 감사 합니다. 이 작품은 노르웨이의 연구 위원회, 보조금 번호 244461 (양식 프로그램) 및 248828 (디지털 라이프 노르웨이 프로그램)와 NMBU에 의해 투자 되었다.

처리 하는 모든 동물 생명 과학의 고 승인된 수 사관의 감독 하에 간호와 노르웨이 대학에서 연구 동물의 복지에 대 한 권고에 따라 수행 되었다.
1입니다. 기기 및 솔루션의 준비
참고: 모든 솔루션 살 균 해야 합니다. 주의 산도를 신중 하 게 공부 종의 extracellular 환경에 적응 해야 합니다 모든 솔루션의 osmolality (osmol/kg 물) 주어져야 한다. pH와 osmolality 조정 ...

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뇌-뇌 하 수 체 조각에 패치 클램프 기법을 사용 하 여 electrophysiological 녹음 주의 최적화가 필요 합니다. 특히 teleosts에서에서 라이브 셀 조사 수행을 위한 최적화 되 프로토콜 대부분 포유류 시스템 기반 프로토콜을 사용 하 여 발행물의 제한 됩니다. 이와 관련, 그것은 중요 한 사실을 pH 및 osmolality 같은 여러 생리 적 매개 변수 종류가 뿐만 아니라 종속, 하지만 또한 매우 여부 유기 체에 살고 땅에...

뇌 하 수 체는 척추 동물 시상 아래 위치 하 고 광학 chiasm에 후부 키 내 분 비 기관 이다. 그것은 생성 하 고 특정 세포 유형에서 6 ~ 8 호르몬을 secretes. 뇌 하 수 체 호르몬 두뇌와 주변 장기 사이의 중간을 구성 하며 다양 한 성장, 재생산, 그리고 항상성의 규칙을 포함 하 여 필수적인 생리 적 프로세스를 드라이브 합니다. 유사한 신경 세포는 뇌 하 수 체의 내 분 비 세포는 활동 전위를 자발적으로 발사 하는 기능으로 전기 고르기 1. 이 활동 전위의 역할은 종속 셀. 포유류의 뇌 하 수 체의 여러 세포 유형에서 활동 전위 수 상승 세포내 캘리포니아2 + 2호르몬 지속적인된 출시에 대 한 충분 합니다. 또한,는 뇌 세포 3,4,,56막 잠재력에 영향을 미치는 뇌에서 stimulatory와 금지 정보를 받습니다. 일반적으로, 물질로 입력은 흥분을 증가 하 고 자주 세포내 상점에서 캘리포니아2 + 의 출시를 포함 뿐만 아니라 발사 주파수 7증가. 셀 이온 채널 구성 활용 방법과 뇌에서 이러한 입력된 신호에 맞게 이해 이해 호르몬 합성 및 릴리스의 열쇠입니다.
패치 클램프 기술 Sakmann 및 정치학자 8,,910 에 의해 1970 년대 후반에 개발 되었고 더 해 밀 11, 개선 셀 electrophysiological 속성의 상세한 조사를 허용 하 고 단일 이온 채널 아래로 또한, 기술은 공부 하는 전류와 전압에 대 한 사용할 수 있습니다. 오늘, 패치 클램핑 셀의 electrophysiological 속성을 측정 하기 위한 황금 표준입니다. 단단한 물개 패치 클램프 기술의 4 개의 주요 구성 되어 개발된 11; 셀 연결 된 내부, 외부 아웃을 전체 셀 패치. 3 첫 번째 구성 단일 이온 채널 수사를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 4, 다음 셀 연결 구성에 대 한 세포 막에 구멍 하위 대기 압력을 사용 하 여 이루어집니다. 이 구성에는 또한 12전체 세포 이온 채널 구성의 조사 수 있습니다. 그러나,이 기술의 한 가지 제한 세포질 분자는 패치 피 펫 솔루션 13 그림 1(A), 따라서 공부 셀의 전기 및 생리 적인 응답에 영향을 미치는 희석 하는. 사실, 그 분자의 일부 신호 변환 또는 다른 이온 채널의 규칙에서 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 이 방지 하려면 린다 우와 페르난데스 14 방법을 개발 기 공 형성 화합물 패치 피 펫에 추가 됩니다. 셀 연결 된 구성에 따라 화합물 패치 아래 플라즈마 막으로 통합 하 고 천천히 cytosol (그림 1B)와 전기 접촉을 만드는 막 구멍. Nystatin 15 와 암포 B 16, 같은 여러 다른 antifungals 또는 사포닌 베타-escin 17,18 같은 계면 활성 제를 사용할 수 있습니다. 이러한 화합물 생성 여러차례 양이온 및 Cl- 고분자 및 캘리포니아2 + 15와 같은 더 큰 이온의 cytosolic 레벨을 유지 하면서는 cytosol와 패치 피펫으로 사이 보급 수 있도록 충분히 큰 모 공 16.
구멍이 패치를 사용 하 여의 전에 잠재적으로 높은 직렬 저항입니다. 직렬 저항 (Rs) 또는 액세스 저항 결합 된 저항 지상 기준으로 패치 피 펫 이다. 패치 클램프 기록 하는 동안 Rs 막 저항 병행에서 될 것입니다 (Rm). Rm 그리고 Rs 전압 분배기로 병렬 작업에. 높은 Rs, 전압 기록에서 오류를 주는 Rs 이상 떨어질 것 이다. 오류 기록 큰 해류와 더 큰 될 것입니다. 또한, 전압 분배기 주파수 의존 따라서 시간적 해상도 영향을 미치는 로우-패스 필터 만들기 이기도 합니다. 사실상 구멍이 패치 항상 수 없습니다 크고 빠른 해류의 같은 전압 문이 나+ 전류 (에 대 한 자세한 읽기 참조 19참조). 또한, Rs 패치 클램프 기록, 다시 기록 된 전류에 변화를 선도 하는 동안 달라질 수 있습니다. 따라서, 가양성 Rs 약물 응용 프로그램 하는 동안 변경 하는 경우에 발생할 수 있습니다.
슬라이스 조직에 전기 생리학 20뇌 뉴런의 electrophysiological 특성 연구 앤더슨 연구소에 의해 처음 도입 되었다. 기술은 더 그대로 환경에서 세포-세포 통신 및 셀 회로 서 단일 셀의 상세한 수사에 대 한 방법을 포장. 뇌 조각을 만들기 위한 유사한 기술 Guérineau 그 외 여러분 에 의해 1998 년에 도입 되었다 그러나 21., 그것은 그의 뇌-뇌 하 수 체 슬라이스 준비 teleost 22패치 클램프 연구 성공적으로 사용 되었다 2005 년 전에. 이 연구에서 저자는 또한 구멍이 패치 클램프 기록의 사용을 보고 했다. 그러나, 지금까지, 대부분의 뇌 세포의 electrophysiological 조사 실시 되었습니다 포유류, 그리고 teleost 물고기 1,,222,23 포함 하 여 다른 척추 동물의 소수에서 . Teleosts에 거의 모든 연구에 수행 기본 해리 셀 24,25,26,,2728,29,30 .
현재 신문에서 우리 모델 물고기 메 다카에서 건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각의 준비를 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 접근 기본 천연된 세포 배양에 비해 몇 가지 장점을 나타냅니다. 첫째, 세포 해리 세포 문화 조건에 비해 상대적으로 보존된 환경에 기록 됩니다. 둘째, 슬라이스 준비 공부는 해리 셀 문화 조건에 불가능-셀 통신 22, 중재 하는 간접 경로 수 있습니다. 또한, 기 공 형성 요원으로 암포 b 천공된 전체 셀 패치 클램프 기법을 사용 하 여 얻은 조직 조각에 electrophysiological 녹음을 수행 하는 방법을 보여 줍니다.
메 다카는 작은 민물고기 아시아, 주로 일본에서 발견 이다. 메 다카의 유전학, 발생 학, 생리학 광범위 하 게 연구 100 년 31, 그리고 그것은 많은 실험실에서 일반적으로 사용 되 연구 모델. 이 종이에 특별 한 중요성의 teleost 물고기에 시상 하 부-뇌 하 수 체 복합물의 독특한 형태학 조직 이다: 포유류와 조류 hypothalamic 뉴런 릴리스 그들의 신경-호르몬 뇌 하 수 체 내 분 비 세포를 조절 하는 반면 중간 예 하의 포털 시스템으로 hypothalamic 뉴런 teleost 물고기 32에서 뇌 하 수 체의 내 분 비 세포의 직접적인 긴장 투영이입니다. 따라서, 물고기, 잘 보존 된 뇌-뇌 하 수 체 네트워크에 뇌 세포와 특히 어떻게 뇌 세포의 electrophysiological 특성을 조사할 수 있는 특별 한 중요성의 이다 신중 하 게 실시 뇌-뇌 하 수 체 부 러 뜨 리 그들의 흥분을 제어 함으로써 캘리포니아2 + 항상성.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Vibratome</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:157px;">VT1000 S</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Chirurgical glue</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td>VETBOND</td>
			<td style="width:428px;">3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Stainless steel blades</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>752-1-SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">metal molds</td>
			<td style="width:171px;">SAKURA</td>
			<td style="width:157px;">4122</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">steel harp</td>
			<td style="width:171px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:157px;">64-1417</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">PBS</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">D8537</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultrapure LMP agarose</td>
			<td style="width:171px;">invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">166520-100</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:309px;">patch pipettes</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF150-110-10HP</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Microscope Slicescope</td>
			<td style="width:171px;">Scientifica</td>
			<td style="width:157px;">pro6000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">P-Clamp10</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">#1-2500-0180</td>
			<td style="width:428px;">sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Digitizer Digidata 1550A1</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">DD1550</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">1-CV-7B</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">GnRH</td>
			<td style="width:171px;">Bachem</td>
			<td style="width:157px;">4108604</td>
			<td style="width:428px;">H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">P-1000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">amphotericin B</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A9528</td>
			<td style="width:428px;">pore-forming antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyethylenimine&#160;</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">P3143</td>
			<td style="width:428px;">50% PEI solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microfiler syringe</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td style="width:157px;">MF28/g67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">glass for the agar bridge</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF200-116-15</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Manager software</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:428px;">Open Source Microscopy Software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">optiMOS sCMOS camera</td>
			<td style="width:171px;">Qimaging</td>
			<td style="width:157px;">&#160;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">sonicator</td>
			<td style="width:171px;">Elma</td>
			<td style="width:157px;">D-7700 singen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MgCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hepes</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">CaCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-mannitol</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">63565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MES-acid</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">M0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">BSA</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

뇌 세포의 electrophysiological 조사 다 척 추가 있는 종, 하지만 거의 teleost 물고기에 실시 되었습니다. 이 중, 분명 대다수 해리 1 차 셀에 수행 되었습니다. 어떻게 teleost 뇌 세포에 대 한 우리의 이해를 개선, 더 많은 생물학 관련 환경에서 작동,이 프로토콜에는 작은 민물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 가능한 뇌-뇌 하 수 체 슬라이스를 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 뇌-뇌 하 수 체 조각 만들기, pH 및 모든 솔루션의 osmolality 25 ~ 28 ° c.에 사는 민물 물고기의 체액에서 발견 하는 값을 조정 했다 조각 준비, 다음 프로토콜 electrophysiological 녹음 천공된 전체 셀 패치-클램프 기술을 사용 하 여 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 패치 클램프 기술 전례 없는 시간적 해상도와 감도, 단일 이온 채널 아래로 그대로 전체 세포에서 전기적 특성의 조사를 수 있도록 강력한 도구입니다. 세포내 환경 그대로에서 패치 피 펫 전극 솔루션에 의해 희석되는 cytosol에서 규제 요소를 방지를 유지에 구멍이 패치는 고유 합니다. 대조적으로, 전통적인 전체 셀 녹화를 수행할 때 메 다카 뇌 세포 신속 하 게 활동 전위를 발사 하는 그들의 기능을 잃고 관찰 되었다. 다양 한 기 공 기술을 사용할 수 있는, 중이 프로토콜 암포 B. 살 균 제를 사용 하 여 패치 막의 천공을 달성 하는 방법을 보여 줍니다.

이 프로토콜 어디 대상 세포 (Lh 생산 gonadotropes) 한 메 다카 유전자 변형 라인 [Tg (lhb-hrGfpII)]를 사용 하 여 뇌 하 수 체 (gonadotrope) 셀에서 안정적인 electrophysiological 녹음을 달성 하는 방법의 단계 프로토콜을 보여 줍니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시 됩니다.
처음, electrophysiological 조사 전체 셀 구성을 사용 하 여 실시 ?...

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Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

설명 하는 최적화 된 프로토콜을 electrophysiological 녹음으로 패치 클램프 기술을 사용 하 여 뇌 세포의 뒤에 가능한 뇌-뇌 하 수 체 조직을 조각, teleost 물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 만들기는 구멍이 패치 구성입니다.

건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 Teleost 물고기에 뇌 세포의 Electrophysiological 조사에 대 한

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

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의 거대한 섬유 패스에서 Electrophysiological 레코딩 D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

연구

신경과학

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

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Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

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The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

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