Name: healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

Vi takker Ms. LourdesCarreon G Tan for hennes hjelp opprettholde medaka anlegget og Anthony Peltier for illustrerende tallene. Dette arbeidet ble finansiert av NMBU og av Norges forskningsråd, gi tall 244461 (akvakultur program) og 248828 (Digital Livet Norge program).

Alle dyr behandling ble utført i henhold til anbefalingene og dyrevelferd forskning ved Universitetet biovitenskap og under tilsyn av autoriserte etterforskere.
1. forberedelse av instrumenter og løsninger
Merk: Alle løsninger skal sterilt. Spesiell oppmerksomhet bør gis til pH og osmolality (osmol/kg vann) av alle løsninger, som bør være nøye tilpasset ekstracellulære miljøet av studerte arter. pH og osmolality burde være innstilt med presis elektronisk ut...

<ol>
	<li>Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+and+signaling+in+the+pituitary+gland.">Ion channels and signaling in the pituitary gland.</a> Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).</li><li>Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+basis+of+pituitary+cell+type-specific+Ca2++signaling-secretion+coupling.">Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling.</a> Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).</li><li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-D2+actions+on+voltage-dependent+calcium+current+and+gonadotropin-II+secretion+in+cultured+goldfish+gonadotrophs.">Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs.</a> J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).</li><li>Chang, J. P., Pemberton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+GnRH-Stimulated+signal+transduction+in+the+vertebrate+pituitary+-+Contributions+from+teleost+model+systems.">Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems.</a> Mol Cell Endocrinol. , (2017).</li><li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inward+membrane+currents+and+electrophysiological+responses+to+GnRH+in+ovine+gonadotropes.">Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).</li><li>Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+as+a+Prolactin+(PRL)+Inhibitor.">Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor.</a> Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).</li><li>Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GnRH-Induced+[Ca2+]i-signalling+patterns+in+mouse+gonadotrophs+recorded+from+acute+pituitary+slices+in+vitro.">GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro.</a> Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).</li><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Neher, E., Baker, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Techniques in cellular physiology. , 4-19 (1981).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Cahalan, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques:+an+overview.">Patch clamp techniques: an overview.</a> Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).</li><li>Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Channel Recording. , 113-114 (1983).</li><li>Lindau, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE-mediated+degranulation+of+mast+cells+does+not+require+opening+of+ion+channels.">IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels.</a> Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li><li>Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+access+resistance+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B.">Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).</li><li>Fan, J. S., Palade, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforated+patch+recording+with+beta-escin.">Perforated patch recording with beta-escin.</a> Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).</li><li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+primary+culture+of+pituitary+cells+from+the+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).+The+importance+of+osmolality,+pCO(2),+and+pH.">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH.</a> Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).</li><li>Sigworth, F. J., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 3-35 (1983).</li><li>Andersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+slices+-+a+neurobiological+tool+of+increasing+usefulness.">Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness.</a> Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).</li><li>Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+spontaneous+Ca2++transients+in+acute+anterior+pituitary+slices.">Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).</li><li>Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotonic+coupling+in+the+anterior+pituitary+of+a+teleost+fish.">Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish.</a> Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).</li><li>Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+of+the+rat+anterior+pituitary:+morphology,+physiology+and+cell-to-cell+communication.">Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication.</a> J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).</li><li>Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ionic+currents+and+electrophysiological+properties+of+goldfish+somatotropes+in+primary+culture.">Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture.</a> Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).</li><li>Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+ionic+currents+in+goldfish+pituitary+cells.">Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).</li><li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+membrane+properties+and+ionic+currents+in+cultured+goldfish+gonadotrophs.">Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs.</a> Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).</li><li>Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+increases+of+dissociated+tilapia+prolactin+cells+in+response+to+hyposmotic+and+depolarizing+stimuli.">Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli.</a> Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).</li><li>Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+pituitary+cells+in+primary+culture+from+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).">Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).</li><li>Strandabo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Hodne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+differences+between+fshb-+and+lhb-expressing+gonadotropes+in+primary+culture.">Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture.</a> Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka--a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).</li><li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes,+amphibians,+and+reptiles.">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pCLAMP+10+Data+Acquisition+and+Analysis+For+Comprehensive+Electrophysiology+User+Guide.">pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide.</a> Molecular Devices Corporation. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiClamp+700B+COMPUTER-CONTROLLED+MICROELECTRODE+AMPLIFIER+Theory+and+Operation.">MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation.</a> Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).</li><li>Dominguez-Mancera, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+regulation+of+inward+membrane+currents,+electrical+activity+and+LH+release+in+isolated+bovine+gonadotropes.">Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).</li><li>Schmidt-Nielsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , 613 (1997).</li><li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+determinants+of+normal+arterial+plasma+pH+in+ectothermic+vertebrates.">Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates.</a> J Exp Biol. 205, 641-650 (2002).</li><li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dependence+of+normal+arterial+blood+pH+on+sodium+concentration+in+teleost+fish.">The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).</li><li>Heming, T. A., Blumhagen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+acid-base+and+electrolyte+states+of+rainbow+trout+exposed+to+alum+(aluminum+sulphate)+in+acidic+and+alkaline+environments.">Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments.</a> Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).</li><li>Reeves, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+body+temperature+and+acid-base+balance+in+ectothermic+vertebrates.">The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates.</a> Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).</li><li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature:+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency.">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li><li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka,+Oryzias+latipes.">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Lett. 2, 12 (2016).</li><li>Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ion+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B.">The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).</li><li>Holz, R., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water+and+nonelectrolyte+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B.">The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).</li></ol>

Elektrofysiologiske opptak ved hjelp av patch-klemme teknikk på hjernen-hypofysen skiver krever forsiktig optimalisering. Godt optimalisert protokoller for gjennomføring av live-celle undersøkelser i teleoster er begrenset, med fleste publikasjoner bruke protokoller basert på pattedyr systemer. I denne forbindelse er det viktig å være klar over det faktum at flere fysiologiske parametere som pH og osmolality er ikke bare arter avhengig, men også mye avhengig om organismen i spørsmålet bor på land eller i vann. ...

Hypofysen er en nøkkel endokrine organ i virveldyr ligger under hypothalamus og bakenfor optikk chiasm. Det produserer og skiller ut seks til åtte hormoner fra de spesifikke celletyper. Hypofysen hormoner utgjør et mellomledd mellom hjernen og eksterne organer og kjøre en rekke viktige fysiologiske prosesser, inkludert vekst og reproduksjon regulering av homeostase. Lik neurons, endokrine cellene i hypofysen er elektrisk nervøs muligheten til å skyte action potensialer spontant 1. Rollen som disse action potensialene er celle avhengige. I flere celletyper pattedyr hypofysen, kan action potensialer heve den intracellulær Ca2 + tilstrekkelig for en vedvarende release av hormon 2. I tillegg mottar hypofysen både stimulerende og hemmende informasjon fra hjernen som påvirker membran potensialet i celler 3,4,5,6. Vanligvis stimulerende input øker excitability og ofte innebærer utgivelsen av Ca2 + fra intracellulær butikker samt økt avfyring frekvens 7. Forstå hvordan cellen benytter ion kanal sammensetningen og tilpasser seg disse inngangssignaler fra hjernen er nøkkelen til forståelse hormon syntese og slipp.
Patch-klemme teknikken ble utviklet i 1970 av Sakmann og Neher 8,9,10 og ytterligere forbedret av Hamill 11, og gir detaljerte undersøkelser av elektrofysiologiske egenskaper av celler ned enkelt ionekanaler. Videre er kan teknikken brukes for å studere både strøm og spenning. I dag, er patch-klemanordning gull standard for måling av elektrofysiologiske egenskaper av cellen. Fire store konfigurasjoner av tett patch-klemme teknikken har vært utviklet 11; celle-vedlagt, innsiden ut, på utsiden ut og hele celle oppdateringen. De tre første konfigurasjonene brukes vanligvis for enkelt ion kanal undersøkelser. For det fjerde, etter celle tilknyttet konfigurasjonen, er hull i cellemembranen fremstilt med sub atmosfærisk trykk. Denne konfigurasjonen tillater også undersøkelser av ion kanal sammensetningen av hele cellen 12. Imidlertid er en begrensning av denne teknikken at cytoplasmatiske molekyler er utvannet av oppdateringen pipette løsning 13 (figur 1A), noe som påvirker de elektriske og fysiologiske responser av studerte celler. Faktisk kan noen av disse molekyler spille viktige roller i Albin på signalet eller regulering av ulike ionekanaler. For å unngå dette, utviklet Lindau og Fernandez 14 en metode der en pore-forming sammensatt legges til oppdateringen pipette. Etter celle tilknyttet konfigurasjonen, sammensatte vil innlemme i plasma membranen under oppdateringen og sakte autoperforering membranen lage elektrisk kontakt med stoffer (figur 1B). Du kan bruke flere ulike antifungals som nystatin 15 og amfotericin B 16eller tensider som saponin beta-escin 17,18 . Disse forbindelser opprette porene stor nok monovalent kasjon og Cl- spredning mellom stoffer og patch pipette samtidig bevare cytosolic nivåene av makromolekyler og større ioner som Ca2 + 15, 16.
Utfordringen med å bruke perforert oppdateringen er potensielt høy serien motstanden. Serien motstand (Rs) eller access motstand er motstand oppdateringen Pipetter i forhold til bakken. Under oppdateringen-klemme innspillinger, Rs vil være parallelt med membran motstand (Rm). Rm og Rs i parallell arbeid som en spenning skillelinjen. Med høy Rs, faller spenningen over Rs gir feil i opptak. Feilen blir større med større strøm registrert. I tillegg er spenning delelinjen også frekvens avhengige oppretter et low pass-filteret, noe som påvirker timelige oppløsningen. Faktisk kan perforert oppdateringen ikke alltid tillate opptak av stor og raskt strømninger som spenningen gated Na+ strøm (for detaljerte lesninger se referanse 19). Også variere Rs under oppdateringen-klemme innspillinger, igjen fører til endringer i registrert gjeldende. Dermed oppstå falske positiver i situasjoner der Rs endres under medikament programmet.
Elektrofysiologi på skiver vevet ble først introdusert av Andersen lab å studere elektrofysiologiske kjennetegner nervecellene i hjernen 20. Teknikken banet vei for detaljert enkeltceller i tillegg til celle-celle kommunikasjon og celle kretser i et mer intakt miljø. En lignende teknikk for å lage hypofysen stykker ble introdusert i 1998 av Guérineau et al. 21. det var imidlertid ikke før 2005 at hjernen-hypofysen skive forberedelse ble brukt med hell i patch-klemme studier i teleost 22. I denne studien rapportert forfatterne også bruk av perforerte patch-klemme innspillinger. Imidlertid langt, er de fleste av elektrofysiologiske undersøkelser av hypofysen celler utført i pattedyr, og bare en håndfull andre virveldyr, inkludert teleost fisk 1,2,22,23 . I teleoster, ble nesten alle studier utført på primære dissosiert celler 24,25,26,27,28,29,30 .
I dagens papir skissere vi en optimalisert protokoll for utarbeidelse av sunn hjernen-hypofysen skiver fra modellen fisk medaka. Tilnærmingen representerer flere fordeler sammenlignet med primære dissosiert cellekulturer. Først registreres cellene i et relativt bevart miljø forhold til avstand celle kultur forhold. Andre tillate skive forberedelser oss å studere indirekte trasé formidlet av celle-celle kommunikasjon 22, hvilke er ikke mulig i dissosiert celle kultur forhold. Videre viser vi hvordan man skal gjennomføre elektrofysiologiske opptak innhentet vev skiver med perforert hele celle patch-klemme teknikken amfotericin B som pore-forming agent.
Medaka er en liten fisk i Asia hovedsakelig funnet i Japan. Den fysiologi, embryologi og genetikk av medaka har blitt grundig studert for over 100 år 31, og det er en vanligvis anvendt forskning modell i mange laboratorier. Spesielt viktig å dette papiret er forskjellige morfologiske organiseringen av hypothalamus-hypofyse-kompleks i teleost fisk: mens pattedyr og fugler av hypothalamus nevroner løslate deres Nevro-hormoner som regulerer hypofysen endokrine celler i portal system på medianen eminense er det en direkte nervøse projeksjon av hypothalamus nevroner på endokrine cellene i hypofysen i teleost fisk 32. Dermed er nøye gjennomført hjernen-hypofysen kutting av særlig betydning fisk, slik at vi kan undersøke elektrofysiologiske kjennetegner hypofysen cellene i et godt bevart hjernen-hypofysen, og spesielt hvordan hypofysen celler kontrollere deres excitability og dermed Ca2 + homeostase.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1065">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Vibratome</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:157px;">VT1000 S</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Chirurgical glue</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td>VETBOND</td>
			<td style="width:428px;">3M Vetbond Tissue Adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Stainless steel blades</td>
			<td>Campden Instruments</td>
			<td>752-1-SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">metal molds</td>
			<td style="width:171px;">SAKURA</td>
			<td style="width:157px;">4122</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">steel harp</td>
			<td style="width:171px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:157px;">64-1417</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">PBS</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">D8537</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultrapure LMP agarose</td>
			<td style="width:171px;">invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">166520-100</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:309px;">patch pipettes</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF150-110-10HP</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Microscope Slicescope</td>
			<td style="width:171px;">Scientifica</td>
			<td style="width:157px;">pro6000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">P-Clamp10</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">#1-2500-0180</td>
			<td style="width:428px;">sofware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Digitizer Digidata 1550A1</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">DD1550</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td>
			<td style="width:171px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:157px;">1-CV-7B</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">GnRH</td>
			<td style="width:171px;">Bachem</td>
			<td style="width:157px;">4108604</td>
			<td style="width:428px;">H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">P-1000</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">amphotericin B</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A9528</td>
			<td style="width:428px;">pore-forming antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polyethylenimine&#160;</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">P3143</td>
			<td style="width:428px;">50% PEI solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microfiler syringe</td>
			<td style="width:171px;">WPI</td>
			<td style="width:157px;">MF28/g67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">glass for the agar bridge</td>
			<td style="width:171px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:157px;">BF200-116-15</td>
			<td style="width:428px;">Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Manager software</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:428px;">Open Source Microscopy Software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">optiMOS sCMOS camera</td>
			<td style="width:171px;">Qimaging</td>
			<td style="width:157px;">&#160;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">sonicator</td>
			<td style="width:171px;">Elma</td>
			<td style="width:157px;">D-7700 singen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MgCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hepes</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">CaCl2</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td style="width:157px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-mannitol</td>
			<td style="width:171px;">SiGMA</td>
			<td align="right" style="width:157px;">63565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MES-acid</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">M0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">BSA</td>
			<td style="width:171px;">SIGMA</td>
			<td style="width:157px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

Elektrofysiologiske undersøkelser av hypofysen celler har vært gjennomført i mange virveldyr arter, men svært få i teleost fisk. Blant disse er et klart flertall utført på avstand primære celler. Forbedre vår forståelse av hvordan teleost hypofysen celler, oppfører seg i et mer biologisk relevante miljø, viser denne protokollen hvordan å forberede levedyktig hjernen-hypofysen skiver med liten fisk medaka (Oryzias latipes). Gjør hjernen-hypofysen skiver, ble pH og osmolality av alle løsninger justert til verdiene i kroppsvæsker hos fisk som lever på 25 og 28 ° C. Etter sektor forberedelse demonstrerer protokollen hvordan å gjennomføre elektrofysiologiske opptak med perforert hele celle patch-klemme teknikk. Patch-klemme teknikken er et kraftig verktøy med enestående timelige oppløsning og følsomhet, tillater undersøkelse av elektriske egenskaper fra intakt hele celler ned enkelt ionekanaler. Perforert oppdateringen er unik ved at den holder intracellulær miljøet intakt hindrer regulatoriske elementer i stoffer i å bli utvannet av oppdateringen pipette elektrode løsningen. I kontrast, når du utfører tradisjonell hele celle innspillinger, ble det observert at medaka hypofysen cellene raskt mister evnen til å skyte action potensialer. Blant de ulike perforering teknikkene tilgjengelig demonstrerer denne protokollen hvordan å oppnå perforering av lappet membranen bruker soppdreper amfotericin B.

Denne protokollen viser protokollen steg for steg hvordan du kan oppnå pålitelig elektrofysiologiske opptak fra hypofysen (gonadotrope) celler, ved å bruke medaka transgene: [vs (lhb- hrGfpII)] hvor målet celler (Lh-produserende gonadotropes) er merket med grønne fluorescerende protein (GFP).
Først ble elektrofysiologiske undersøkelser gjennomført med hele celle-konfigurasjon. Spontan handling potensialer ble im...

Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Artikkelen beskriver en optimalisert protokoll for å gjøre levedyktig hjernen-hypofysen vev skiver, bruke teleost fisk medaka (Oryzias latipes), etterfulgt av elektrofysiologiske opptak av hypofysen celler ved hjelp av patch-klemme teknikken med den perforert oppdateringen konfigurasjon.

Sunn hjernen-hypofysen skiver for elektrofysiologiske undersøkelser av hypofysen celler i Teleost fisk

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

I Vivo Elektro Målinger på mus sciatic nervene

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Sammenkoblede hele cellen Recordings i organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektro og Morfologisk Karakterisering av Nevronale kretser i Akutt Brain Slices hjelp Grupperte patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Disseksjon av Fear kretser i hjernen skiver

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Utarbeidelse av Horisontale Skiver av Adult Mouse Retina for Elektro Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

Elektrofysiologisk undersøkelser av Retinogeniculate og Corticogeniculate synapse funksjon

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...