Name: defined xeno-free and feeder-free culture conditions for the generation of human ipsc-derived retinal cell models
Uploaded: 2018-09-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models at JoVE.com

Die Autoren möchten beim Aufbau der hier beschriebenen Methoden und G. Gagliardi und M. Garita für ihre kritischen Lektüre Goureau Team für ihre Beiträge danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), die Netzhaut Frankreich Association und der Technologietransfer Unternehmen SATT Lutech. Es wurde auch im Rahmen der LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) unterstützt durch die ANR programmintern Investissements Avenir (ANR-11-IDEX-0004-02) durchgeführt.

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen folgt den Richtlinien des Institut De La Vision forschungsethikkommission. Das Institut De La Vision wurde die Manipulation des menschlichen Probe gemäß der aktuellen französischen Verordnung zugelassen. Handhabung der Proben folgt Patientendaten Schutz im Einklang mit den Grundsätzen von Helsinki und nationalen Regelungen nach der ethischen Genehmigung des "Comité de Protection des Personnes (CPP) Ile V".
1. Vorbereitung der Kultur, Medien und...

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	<li>Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+retinal+diseases:+recapitulating+development+to+replace+degenerated+cells.">Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells.</a> Development. 144, 1368-1381 (2017).</li><li>Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+There+Be+Light:+Gene+and+Cell+Therapy+for+Blindness.">Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness.</a> Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).</li><li>Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. 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B., Collin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1+Signalling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three+dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells.">IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).</li><li>Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors.">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).</li><li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li><li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).</li><li>Reichman, S., Slembrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+ips+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).</li><li>Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8, 424-429 (2011).</li><li>Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibition+extends+passage+of+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium.">ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).</li><li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina.">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt die RPE-Zellen und Netzhaut Organellen mit retinalen Routinggruppenconnectors und Photorezeptoren, aus menschlicher pluripotenter Stammzellen im Xeno frei und Feeder Bedingungen produzieren. Kompatibel mit der Good Manufacturing Practice (GMP), die Methode kultiviert hier vorgestellten ermöglicht eine große Produktion von iPSC-abgeleitete netzhautzellen RPE Zellen Routinggruppenconnectors und Photorezeptoren für die Entwicklung der stammzellbasierte Therapien und Medikamenten Entdeckung-Ans...

Die Netzhaut ist Bestandteil des zentralen Nervensystems (ZNS) und hat eine begrenzte Kapazität, spontan nach einer traumatischen Verletzung oder Krankheiten zu regenerieren. Daher führen degenerative Pathologien verursachen definitive retinalen Zellverlust, wie Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa (RP), Glaukom und Diabetische Retinopathie, in der Regel zur irreversiblen Erblindung. Rettung der degenerierten Netzhaut ist eine große Herausforderung für die stammzellbasierte Therapien mit dem Ziel, ersetzen Sie die beschädigten oder verloren gegangene Zellen eine der vielversprechendsten Ansätze1,2,3 sind. Pluripotente Stammzellen als menschlicher embryonaler Stammzellen (WSR) Zellen oder Mensch-induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) haben die Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in Kultur erweitert werden, und sie haben das Potenzial, alle Arten von Zellen zu produzieren. Fortschritte im Verständnis der retinalen Entwicklung und die Verbesserung der in-vitro- Protokolle für menschlichen iPSC Differenzierung führten zu der Generation von retinalen Organellen7,8,9, 10,11,12. Alle wichtigen retinalen Zellen, einschließlich der retinalen Ganglienzellen (Routinggruppenconnectors), Photorezeptoren und Netzhaut pigmentiert (RPE) Epithelzellen, haben erfolgreich unterschieden von menschlichen WSR und iPSCs4,5, 6. basierend auf der SFEB (serumfreien Kultur Embryoid Körper-wie Aggregate)-Methode, entwickelt von Eiraku Et Al. 13, erhalten Sie zur Bildung von retinalen Organellen von ESC oder iPSC abgeleitet Embryoid Körper-ähnlichen Aggregaten in definierten extrazelluläre Matrix Komponenten7,10,14. Aber diese Protokolle sind kompliziert, erfordert eine große Anzahl von Schritten nicht immer kompatibel mit der Großserienfertigung von Zellen für therapeutische Ansätze oder Drogen-Screening. So, die Wahl der Methode, menschliche netzhautzellen zu produzieren ist von entscheidender Bedeutung und die Methode muss robuste, skalierbare und effizient sein.
Hier, beschreiben basierend auf unseren vorherigen Veröffentlichung15, wir alle notwendigen Schritte für eine einfache und effiziente Generation von netzhautzellen durch Netzhaut organoide Self Bildung von anhaftenden menschlichen iPSCs in einem Feeder frei und Xeno Zustand gepflegt. Ausgehend von routinemäßigen Kulturen der anhaftende menschliche iPSCs, erfordert dieses Protokoll nur eine einfache aufeinanderfolgenden Medium ändern, um die Erzeugung von iPS-gewonnenen RPE (HiRPE) Zellen und neuroretinale Strukturen in 4 Wochen zu ermöglichen. Nach einer manuellen Isolierung HiRPE erweitert werden kann und die Netzhaut Strukturen können gezüchtet werden, als schwimmende Organellen wo sind die retinale Vorläuferzellen in alle retinale Zelltypen in einer sequentiellen Reihenfolge Einklang mit der in-Vivo -Mensch zu unterscheiden Retinogenesis. Zu guter Letzt für Forschung Fortschritt oder Übersetzung klinischer beschreiben wir eine Kryokonservierung Methode ermöglicht die langfristige Lagerung der gesamten Netzhaut Organellen und HiRPE Zellen ohne Beeinträchtigung ihrer phänotypischen Eigenschaften und Funktionalität.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1370701</td>
			<td>supplement CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS B-27 Supplement, XenoFree</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1486701</td>
			<td>supplement CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320074</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStart CTS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1014201</td>
			<td>Matrix CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostem Freezing Media</td>
			<td>clinisciences</td>
			<td>05-710-1D</td>
			<td>Cryopreservation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>FGF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td>FGF2 Xeno free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGANI needle 23G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*2332R1</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 25 cm&#178; Tissue Culture Treated</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td>T-25 cm&#178;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate Tissue Culture Treated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td>24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate Tissue Culture Treated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>6-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defined xeno-free and feeder-free culture conditions for the generation of human ipsc-derived retinal cell models

Die Produktion von spezialisierten Zellen aus pluripotenten Stammzellen ist ein leistungsstarkes Tool, um neue Ansätze für die regenerative Medizin zu entwickeln. Die Verwendung von Human-induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) ist besonders attraktiv für Neurodegenerative Krankheit Studien, einschließlich retinale Dystrophien, wo mark iPSC-abgeleitete retinalen zellmodelle einen großen Schritt nach vorn zu verstehen und zu bekämpfen Blindheit. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache und skalierbare Protokoll zu generieren, Reifen und Tiefgefrieren retinale Organellen. Basierend auf mittlere ändern, der Hauptvorteil dieser Methode ist es, mehrere zu vermeiden und zeitaufwändigen Schritte häufig in eine geführte Differenzierung der iPSCs erforderlich. Imitiert die frühen Phasen der retinalen Entwicklung durch aufeinander folgende Veränderungen der definierten Medien auf anhaftende menschlichen iPSC Kulturen, dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Erzeugung von selbst-Bildung neuroretinale Strukturen und Netzhaut pigmentiert (RPE) Epithelzellen in eine reproduzierbare und effiziente Weise in 4 Wochen. Diese Strukturen mit retinale Vorläuferzellen (RPCs) können für die weitere Reifung in einem schwimmenden Kultur Zustand ermöglicht die Differenzierung von RPCs in sieben retinalen Zelltypen im Erwachsenen menschlichen Netzhaut leicht isoliert werden. Darüber hinaus beschreiben wir schnelle Methoden für die Kryokonservierung von retinalen Organellen und RPE-Zellen für die langfristige Lagerung. Die hier beschriebenen Methoden werden miteinander kombiniert, zu produzieren und bank menschlichen iPSC-abgeleitete retinalen Zellen oder Gewebe für Grundlagenforschung und klinische Forschung nützlich.

Der erste Schritt zur menschlichen iPSC Differenzierung im Feeder-freien Bedingungen16 angebaut ist zum Herunterfahren Selbsterneuerung Maschinen mit Bi-Medium um zu ermutigen, eine spontane Differenzierung (Abbildung 1A). Dann, bei D2, das Bi-Medium wird ergänzt mit eine N2-Ergänzung zur differenzierenden iPSCs Zellen in Richtung der neuronalen und Netzhaut Linien führen. Dieser Prozess führt zum Auftreten von neuroretinale Knospe...

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Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

Die Produktion von spezialisierten netzhautzellen aus pluripotenten Stammzellen ist ein Wendepunkt in der Entwicklung der Stammzell-Therapie für Erkrankungen der Netzhaut. Der vorliegende Beitrag beschreibt eine einfache Methode für eine effiziente Erzeugung von retinalen Organellen und retinalen Pigment Epithel für Grund-, translationalen und klinischen Forschung.

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

Sammlung von Serum- und Feeder-freie Maus embryonale Zellen konditionierten Medium für eine zellfreie Ansatz Stem

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...