Name: defined xeno-free and feeder-free culture conditions for the generation of human ipsc-derived retinal cell models
Uploaded: 2018-09-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models at JoVE.com

著者は、彼らの重要な読書のため、ここで説明する方法と G. ガリアルディ M. Garita の設定時に、入力のための Goureau のチームのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、ANR からの補助金によって支えられた (GPiPS: ANR-2010-RFCS005;SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02)、網膜フランス協会との技術移転会社船型研究 Lutech。それはまた Investissements d'Avenir プログラム (ANR-11-アイデックス-0004-02) 内で ANR 支え LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) のフレームで行われました。

このペーパーで説明したプロトコルの Institut de la ビジョンの研究倫理委員会のガイドラインに従います。Institut de la ビジョンは、現在のフランス語の規則に従って人間の標本の操作を許可されています。検体の取り扱い"Comité デ保護デ Personnes (CPP) イル V"の倫理的な承認後にヘルシンキの教義に従って患者データ保護と国民の規則に従います。
1. 文化メディアと料理の準?...

<ol>
	<li>Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+retinal+diseases:+recapitulating+development+to+replace+degenerated+cells.">Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells.</a> Development. 144, 1368-1381 (2017).</li><li>Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+There+Be+Light:+Gene+and+Cell+Therapy+for+Blindness.">Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness.</a> Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).</li><li>Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. 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S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).</li><li>Reichman, S., Slembrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+ips+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).</li><li>Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8, 424-429 (2011).</li><li>Croze, R. H., Buchholz, D. 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このプロトコルでは、網膜色素上皮細胞と網膜 Rgc と xeno、フィーダー フリー条件のひと多能性幹細胞から視細胞を含む網膜のオルガノイドを生成する方法について説明します。ここに示すよい製造業練習 (GMP) プロセス、栽培法との互換性により、RPE 細胞、Rgc、幹細胞ベースの治療法や薬の開発のための視細胞と iPSC 由来の網膜細胞の大規模な生産網膜変性疾患の将来の治療発見アプローチ...

網膜は中枢神経系 (CNS) の不可欠な部分で、自発的に次の外傷性の傷害または病気を再生する限られた容量。したがって、糖尿病網膜症、緑内障、網膜色素変性症 (RP) 加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) などの決定的な網膜細胞の損失を引き起こす退行性の病態は、通常、不可逆的な失明に します。変性網膜を救出、破損したまたは失われた細胞を置き換えることを目指して幹細胞ベースの治療が最も有望なアプローチ1,2,3の 1 つで、主要な課題です。ヒト胚性幹細胞 (Esc) 細胞と多能性幹細胞または人間誘導された多能性幹細胞 (Ips) は、文化では、無限に拡張する能力を持っているし、任意のセルの種類を生成する可能性があります。網膜の開発の私達の理解と体外の改善の進歩人間 iPSC 分化がにより網膜 organoids7,8,9の生成のためのプロトコルします。 10、11,12。主要な網膜細胞、網膜神経節細胞 (Rgc)、光受容体、網膜色素上皮 (RPE) 細胞などのすべてが人間 Esc と Ips4,ので5,から正常に分化されている6. 永楽らによって開発された SFEB (胚様体のような骨材の無血清培養) 法に基づく13、網膜オルガノイドの自己形成は、定義された細胞外マトリックス成分7,10,14esc キーまたは iPSC 由来胚様体のような集計から入手できます。しかし、これらのプロトコルは複雑な治療法や創薬スクリーニングのため細胞の大量生産と常に互換性がないステップの多数を必要とします。したがって、人間の網膜の細胞を生成するメソッドの選択が重要とメソッドは、堅牢で拡張性が高く、かつ効率的なする必要があります。
ここでは、当社の以前の文書15に基づいて、我々 はフィーダー、xeno フリー状態で栽培される付着人間 Ips から網膜における自己形成を通じて網膜細胞のシンプルかつ効率的な世代のため各ステップをについて説明します。付着性人間 Ips の日常文化から始まって、このプロトコルは 4 週間で iPS 由来 RPE (hiRPE) 細胞と上方の構造の両方の世代を変更する単純な連続媒体のみを必要があります。手動分離後 hiRPE を展開して網膜の構造は浮動 organoids 網膜前駆細胞が生体内で人間と一貫性のある順番にすべての網膜細胞のタイプに区別することで培養できます。retinogenesis。最後に、研究の進歩や臨床の翻訳は、彼らの表現の特性と機能に影響を与えずに網膜全体 organoids と hiRPE 細胞の長期貯蔵を許可する凍結方法をについて説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1370701</td>
			<td>supplement CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS B-27 Supplement, XenoFree</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1486701</td>
			<td>supplement CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320074</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStart CTS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1014201</td>
			<td>Matrix CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostem Freezing Media</td>
			<td>clinisciences</td>
			<td>05-710-1D</td>
			<td>Cryopreservation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>FGF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td>FGF2 Xeno free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGANI needle 23G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*2332R1</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 25 cm&#178; Tissue Culture Treated</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td>T-25 cm&#178;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate Tissue Culture Treated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td>24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate Tissue Culture Treated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>6-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defined xeno-free and feeder-free culture conditions for the generation of human ipsc-derived retinal cell models

特殊化した細胞から多能性幹細胞の生産には、再生医療のための新しいアプローチを開発する強力なツールが用意されています。人間誘導された多能性幹細胞 (Ips) の使用は、iPSC 由来網膜細胞モデルが理解し失明を戦う主要な一歩前進をマーク網膜ジストロフィーを含む神経変性疾患研究に特に魅力的です。生成、成熟、および網膜オルガノイドを凍結するシンプルかつスケーラブルなプロトコルについて述べる。媒体を変更するに基づいて、このメソッドの主な利点は複数を避けるために、時間のかかる手順は、Ips の誘導分化で要求される一般的。付着性人間 iPSC 文化に定義されているメディアの継時的変化による網膜の開発の初期の段階を模倣、このプロトコルにより上方構造と網膜色素上皮 (RPE) 細胞を自己形成の同時発生、4 週間で再現性のある、効果的な方法。これらの構造体を含む網膜前駆細胞 (Rpc) は、Rpc の大人の人間の網膜内にある 7 網膜細胞型への分化を有効に浮遊培養条件でさらに成熟簡単に分離できます。また、網膜オルガノイドの凍結保存法と長期保存のための網膜色素上皮細胞について述べる。一緒に組み合わせることで、ここで説明する方法は、銀行の iPSC 由来網膜細胞または基礎・臨床研究のためのティッシュを制作し役に立つでしょう。

フィーダー無料条件16で培った人間 iPSC の差別化のための最初のステップです (図 1 a) の分化を促進する双方向の媒体を使用して自己複製機械をシャット ダウンします。双方向メディアを補完する D2 での Ips 細胞神経および網膜の系統へのガイドに N2 サプリメントで。この過程は D28 の周りで上方芽の外観につながります (<stron...

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Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

多能性幹細胞から特殊な網膜細胞の生産は、網膜疾患の幹細胞を用いた治療法の開発のターニング ポイントです。本稿は、並進、基礎および臨床研究のオルガノイドの網膜と網膜色素上皮の効率的な生成の単純な方法をについて説明します。

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

血清やフィーダーフリーのマウス胚のコレクションは、無細胞アプローチのための細胞馴化培地を幹

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（MSC）スフェロイドプライム

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデルフィーダーフリー培養条件