Name: defined xeno-free and feeder-free culture conditions for the generation of human ipsc-derived retinal cell models
Uploaded: 2018-09-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models at JoVE.com

Författarna vill tacka medlemmarna i Goureau's team för deras insatser under installationen av de metoder som beskrivs här, och G. Gagliardi och M. Garita för deras kritisk läsning. Detta arbete stöds av bidrag från ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), föreningen Retina Frankrike och den tekniköverföring företaget SATT Lutech. Det framfördes också inom ramen för den LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) stöds av ANR inom programmet Investissements pris (ANR-11-IDEX-0004-02).

Protokollet beskrivs i detta dokument följer riktlinjerna i Institut de la Visions forskningsetisk kommitté. Institut de la visionen har tillåtits manipulering av mänskliga prov enligt den nuvarande franska förordningen. Provhantering följer patientens dataskydd i enlighet med Helsingfors grundsatser och nationella förordningar efter etiskt godkännande av ”Comité de Protection des Personnes (CPP) Ile-de-France V”.
1. beredning av kultur Media och rätter
<ol><li>
Kultur ...

<ol>
	<li>Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+retinal+diseases:+recapitulating+development+to+replace+degenerated+cells.">Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells.</a> Development. 144, 1368-1381 (2017).</li><li>Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let+There+Be+Light:+Gene+and+Cell+Therapy+for+Blindness.">Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness.</a> Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).</li><li>Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+custom+therapeutics+for+retinal+repair:+Progress+and+rationale.">Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale.</a> Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).</li><li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Stem+Cells+Retinal:+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+with+Ocular+Disease.">Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).</li><li>Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., P&#233;bay, A., Wong, R. C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+Retinal+Ganglion+Cell+Differentiation+From+Pluripotent+Stem+Cells.">Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells.</a> Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).</li><li>Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Patient-specific+stem+cells+to+interrogate+inherited+eye+disease.">Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).</li><li>Nakano, T., Ando, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li><li>Reichman, S., Terray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).</li><li>Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment.">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).</li><li>Zhong, X., Gutierrez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4047 (2014).</li><li>Mellough, C. B., Collin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1+Signalling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three+dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells.">IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).</li><li>Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors.">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).</li><li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li><li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).</li><li>Reichman, S., Slembrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+ips+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).</li><li>Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8, 424-429 (2011).</li><li>Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibition+extends+passage+of+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium.">ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).</li><li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina.">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).</li></ol>

Det här protokollet beskriver hur man producerar RPE-celler och retinal organoids, innehållande retinal RGCs och fotoreceptorer, från mänskliga pluripotenta stamceller i xeno-fri och feeder villkor. Kompatibel med god tillverkningssed (GMP) processen, metoden odlade presenteras här tillåter en stor produktion av iPSC-derived näthinnans celler som RPE celler, RGCs och fotoreceptorer för utveckling av stamceller-baserade terapier och läkemedel Discovery närmar sig för framtida behandling av retinala degenerativa...

Näthinnan är en integrerad del av det centrala nervsystemet (CNS) och har begränsad förmåga att regenerera spontant efter en traumatisk skada eller sjukdomar. Därför, degenerativa sjukdomar orsakar slutgiltiga retinal cellförlust, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP), glaukom och diabetesretinopati, normalt leda till irreversibel blindhet. Undsättning degenererade näthinnan är en stor utmaning som stamceller-baserade terapier som syftar till att ersätta de skadade eller förlorade cellerna är en av de mest lovande metoder1,2,3. Pluripotenta stamceller som mänskliga embryonala stamceller (råden) celler eller mänskliga-inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har kapacitet att utökas på obestämd tid i kultur, och de har potential att producera alla celltyper. Framsteg i förståelsen av retinal utveckling och förbättring av in vitro- protokoll för mänskliga iPSC differentiering har resulterat i generationen av retinal organoids7,8,9, 10,11,12. Alla stora retinala celler, inklusive retinala ganglionceller (RGCs), fotoreceptorer och retinal pigmenterade epitelceller (RPE) har varit framgångsrikt åtskilt från mänskliga och sociala råden och iPSCs4,5, 6. utifrån metoden SFEB (serumfritt kultur av embryoid organ-liknande aggregat) som utvecklats av Eiraku et al. 13, själva bildandet av retinal organoids kan erhållas från ESC - eller iPSC-härledda embryoid organ-liknande aggregat i definierade extracellulär matrix komponenter7,10,14. Men dessa protokoll är invecklade, vilket kräver ett stort antal steg inte alltid kompatibel med stora produktionen av celler för behandlingsmetoder eller drogkontroll. Alltså, valet av metoden att producera mänskliga retinala celler är kritisk och metoden måste vara robust, skalbar och effektiv.
Här beskriver vi baserat på våra tidigare publikation15, varje steg för en enkel och effektiv generation av näthinnans celler genom retinal organoid själv bildas från vidhäftande mänskliga iPSCs odlas i en feeder-fri och xeno skick. Detta protokoll från rutinmässig kulturer av vidhäftande mänskliga iPSCs, och kräver bara en enkel successiva medium förändras så att generationen av både iPS-derived RPE (hiRPE)-celler och neuroretinal strukturer i 4 veckor. Efter en manuell isolering, hiRPE kan utvidgas och retinal strukturer kan vara odlade som flytande organoids där de retinala stamceller ska kunna differentieras till alla retinala celltyper i en ordningsföljd som är konsekvent med människan i vivo retinogenesis. Slutligen, för forskning befordran eller kliniska översättning beskriver vi en frysförvaring metod så att den långsiktiga lagringen av hela retinal organoids och hiRPE celler utan att påverka deras fenotypiska egenskaper och funktionalitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1370701</td>
			<td>supplement CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS B-27 Supplement, XenoFree</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1486701</td>
			<td>supplement CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320074</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStart CTS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1014201</td>
			<td>Matrix CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostem Freezing Media</td>
			<td>clinisciences</td>
			<td>05-710-1D</td>
			<td>Cryopreservation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>FGF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td>FGF2 Xeno free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGANI needle 23G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*2332R1</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 25 cm&#178; Tissue Culture Treated</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td>T-25 cm&#178;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate Tissue Culture Treated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td>24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate Tissue Culture Treated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>6-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defined xeno-free and feeder-free culture conditions for the generation of human ipsc-derived retinal cell models

Produktionen av specialiserade celler från pluripotenta stamceller ger ett kraftfullt verktyg för att utveckla nya tillvägagångssätt för regenerativ medicin. Användningen av mänskliga-inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är särskilt attraktiva för neurodegenerativa sjukdomen studier, inklusive retinala dystrofier, där iPSC-derived retinal cellmodeller markerar ett stort steg framåt att förstå och bekämpa blindhet. I den här artikeln beskriver vi en enkel och skalbar protokoll för att generera, mogen och frysa retinal organoids. Baserat på medellång förändras, den största fördelen med denna metod är att undvika flera och tidskrävande steg krävs allmänt en guidad differentiering av iPSCs. Detta protokoll härma tidiga faser av retinal utveckling av successiva förändringar av definierade media på vidhäftande mänskliga iPSC kulturer, och tillåter samtidig framställning av själv bildar neuroretinal strukturer och retinal pigmenterade (RPE) epitelceller i en reproducerbar och effektivt sätt i 4 veckor. Dessa strukturer som innehåller retinal stamceller (RPC-anrop) kan isoleras enkelt för vidare mognad i ett flytande kultur-villkor som möjliggör differentiering av RPC-anrop till de sju retinal celltyper som förekommer i vuxen mänskliga näthinnan. Dessutom beskriver vi snabba metoder för Frysförvaring av retinal organoids och RPE-celler för långsiktig lagring. Kombineras, kommer att metoderna som beskrivs här vara användbart att producera och bankens mänskliga iPSC-derived retinala celler eller vävnader för både grundforskning och klinisk forskning.

Det första steget för mänskliga iPSC differentiering odlas i feeder-fria villkor16 är att stänga självförnyelse maskiner använder Bi medium för att uppmuntra en spontan differentiering (figur 1A). Sedan, på D2, Bi medium kompletteras med ett N2 tillägg att vägleda särskiljande iPSCs cellerna mot de neurala och retinal härstamningar. Denna process leder till uppkomsten av neuroretinal knoppar på runt D28 (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models at JoVE.com

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Definierade Xeno-fri och Feeder-fri odlingsbetingelser för den Generation av mänskliga iPSC-derived Retinal cellmodeller

Produktionen av specialiserade retinala celler från pluripotenta stamceller är en vändpunkt i utvecklingen av stem cell-baserad terapi för retinala sjukdomar. Detta dokument beskriver en enkel metod för en effektiv generering av retinal organoids och retinal pigmenterade epitel för grundläggande, translationell och klinisk forskning.

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering av inducerade pluripotenta stamceller från humana perifera T-celler med Sendai virus i Feeder fria förhållanden

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fria Derivering av Melanocyter från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

Insamling av Serum och Feeder fria Mouse embryonala stamceller konditionerade medium för ett cellfritt Approach

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Produktion och administrering av terapeutiska mesenkymala stam / Stromacells- (MSC) sfäroiderna Primed i 3-D kulturer Under Xeno fria förhållanden

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation av iPSC härledda mänskliga hjärnan Organoids till modell Tidig nervsystemets sjukdomar

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Omprogrammering primära fostervatten och membran celler att Pluripotency Xeno-fria förhållanden

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hemogena Endotelium differentiering från mänskliga pluripotenta stamceller i en feeder-och Xeno-fritt definierade villkor

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...