Name: isolation, expansion, and adipogenic induction of cd34+cd31+ endothelial cells from human omental and subcutaneous adipose tissue
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить Бекки Маркес, клинических координатором в центре Sentara лечение ожирения, для ее помощи с процессом скрининг и согласие пациента. Это исследование было поддержано R15HL114062 АНКА D. Dobrian.

Организационного комитета Правления обзор Восточной Вирджинии медицинской школы одобрил исследований и сбора образцах адипозных тканей человека, используемые в исследовании. Обоснованное письменное согласие была собрана из пациентов.
1. Подготовка буферов, средств мас...

<ol>
	<li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature.">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322 (5901), 583-586 (2008).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+adipogenic+niche+for+adipose+tissue+remodeling+and+restoration.">Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration.</a> Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).</li><li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+'brite/beige'+adipocytes+develop+from+capillary+networks,+and+their+implantation+improves+metabolic+homeostasis+in+mice.">Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice.</a> Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Tran, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+of+the+adipose+tissue+gives+rise+to+both+white+and+brown+fat+cells.">The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots.">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding.">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Villaret, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+endothelial+cells+from+obese+human+subjects:+differences+among+depots+in+angiogenic,+metabolic,+and+inflammatory+gene+expression+and+cellular+senescence.">Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence.</a> Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).</li><li>Miranville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+postnatal+neovascularization+by+human+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells.</a> Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).</li><li>Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preadipocytes+in+the+human+subcutaneous+adipose+tissue+display+distinct+features+from+the+adult+mesenchymal+and+hematopoietic+stem+cells.">Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).</li><li>Moller, D. E., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance--mechanisms,+syndromes,+and+implications.">Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications.</a> The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li><li>Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+relationships+in+cultured+3T3-L1+preadipocytes.">Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).</li><li>Satish, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+human+adipose-derived+stem+cells+during+in+vitro+differentiation+to+an+adipocyte+lineage.">Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage.</a> BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+endothelial+cells+in+culture.+Growth+and+DNA+synthesis.">Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.</a> The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).</li><li>Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+vascular+bed+origin+influence+differences+in+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries.">Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).</li><li>Paruchuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pulmonary+valve+progenitor+cells+exhibit+endothelial/mesenchymal+plasticity+in+response+to+vascular+endothelial+growth+factor-A+and+transforming+growth+factor-beta2.">Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2.</a> Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).</li><li>Hewett, P. W., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microvessel+endothelial+cells:+isolation,+culture+and+characterization.">Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization.</a> In Vitro Cellular &amp; Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).</li><li>Hewett, P. W., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+microvessel+endothelial+cells:+isolation,+culture,+and+characterization.">Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization.</a> Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).</li><li>Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+microvessel+endothelial+cells+from+human+mammary+adipose+tissue.">Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue.</a> In Vitro Cellular &amp; Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).</li><li>Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+expansion+of+tumor-specific+endothelial+cells.">Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+residing+progenitors+(adipocyte+lineage+progenitors+and+adipose+derived+stem+cells+(ADSC).">Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC).</a> Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+endothelial+progenitor+cells+from+adipose+tissue+as+potential+angiogenic+cell+sources+for+bladder+angiogenesis.">In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis.</a> PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).</li><li>Curat, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+blood+monocytes+to+adipose+tissue-resident+macrophages:+induction+of+diapedesis+by+human+mature+adipocytes.">From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes.</a> Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).</li><li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors.">Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).</li><li>Traktuev, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+multipotent+CD34-positive+adipose+stromal+cells+share+pericyte+and+mesenchymal+surface+markers,+reside+in+a+periendothelial+location,+and+stabilize+endothelial+networks.">A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks.</a> Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).</li><li>Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+of+adipose+tissues:+a+niche+of+adipogenesis.">Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).</li><li>Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cells+in+inflamed+adipose+tissue.">The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue.</a> Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).</li><li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+cell-surface+markers+of+adipose-derived+stem+cells+from+subcutaneous+and+visceral+fat+depots.">Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li><li>Ong, W. K., Sugii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+fatty+potentials+for+therapy.">Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+two+human+preadipocyte+subtypes+with+distinct+capacities+for+replication,+adipogenesis,+and+apoptosis+varies+among+fat+depots.">Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots.</a> American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).</li><li>van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinedione-induced+lipid+droplet+formation+during+osteogenic+differentiation.">Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).</li></ol>

В центре внимания настоящего документа – обеспечить методологию для изоляции, расширения и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от висцеральных и подкожные депо жировых тканях человека.
Методологии были зарегистрированы для изоляции эндотелиальных кле?...

Последние данные показывают, что в мышей и людей, подмножество ячеек, проживающих в сосудистую жировой ткани могут быть продифференцированы в белый или бежевый/коричневый адипоцитов1,2,3. Фенотип таких клеток является предметом споров, с подтверждающей эндотелиальных клеток, гладкие мышцы/перицит или спектр промежуточных фенотипов4,5,6,7. Область разработки этой методологии было проверить адипогенном потенциал CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток, изолированных от различных жировых отложений из тучных людей. Другие исследования в литературе сосредоточены на адипогенном потенциал всего стромальные сосудистой дроби или известных Адипоцит прародителями2,8,9. Поскольку в настоящее время существующих технологий можно ориентировать конкретно эндотелиальные клетки жировой ткани для доставки наркотиков10, понимание потенциал таких клеток пройти адипогенном индукции к белый или бежевый адипоцитов имеет важное значение для будущее целевой терапии.
Различные группы сообщили сочетание CD31 и CD34 маркеры как суррогаты изолировать эндотелиальных клеток от жировых тканях человека11,12,13. Как правило изоляция выполняется с использованием двух последовательных шагов и положительный выбор с помощью магнитной бусины. В настоящем докладе была использована immunoseparation с помощью CD34 + магнитные шарики в сочетании с CD31 пластиковые бусины. Мы нашли этот метод превосходит последовательный магнитные immunoseparation в отношении сохранения типичных булыжником эндотелиальной морфологии. Кроме того мы были способны генерировать достаточно клеток, необходимых для расширения и адипогенном индукции, начиная от всего лишь 1 – 2 g жира. Небольшой пример биопсии подкожного жира достаточно производить необходимое количество клеток для нисходящие приложения. Этот аспект является потенциально важным, особенно, если этот метод будет использоваться для скрининга для оперативности адипогенном индукции в человеке.
В отличие от других систем, в литературе о, этот метод использует только два ингредиенты для индукции адипогенном CD34 + CD31 + клеток: агонист PPARγ — Росиглитазон — и человеческого инсулина. Важно отметить, что количество инсулина используются попадает в диапазон нормальный/высокий циркулирующих post-absorptive инсулина в людях14. Степень реагирования на инсулин клетки в пробирке, измеряется Akt фосфорилирование, не коррелирует с их способность реагировать на индукции коктейль. Интересно, что используя этот индукции коктейль и экспериментальных условиях, смесь белый и бежевый/коричневый клетки были получены как определяется размер и количество внутриклеточной липидного капель и проявление молекулярных маркеров. Этот простой и экономически индукции протокол наряду с количественной оценки фенотипа клетки ответчика (белый и бежевый) позволяет для скрининга агентов, которые потенциально могут изменить баланс дифференцированных бежевый : белый адипоцитов.
Этот метод также предоставляет поступательного подхода для понимания основных механизмов adipogenesis сосудистого эндотелия прародителей в жировых тканях человека. Используя эту технику конкретных изоляции/дифференциация, следователи могут допросить различных путей, ответственный за adipogenesis в подмножестве сосудистой эндотелиальных клеток от различных жировых отложений в худой и тучных людей.

isolation, expansion, and adipogenic induction of cd34+cd31+ endothelial cells from human omental and subcutaneous adipose tissue

Ожирение сопровождается обширной реконструкции жировой ткани главным образом через Адипоцит гипертрофия. Экстремальные Адипоцит роста приводит к плохой ответ на инсулин, местные гипоксии и воспаления. Стимулируя дифференциация функциональных белый адипоцитов из прародителей, радикальные гипертрофия Адипоцит населения могут быть предотвращены, и, следовательно, метаболически здоровье жировой ткани могут быть улучшены наряду с сокращением воспаление. Кроме того стимулируя дифференциация бежевый/коричневый адипоциты, расходование энергии всего тела может быть увеличена, что приводит к потере веса. Этот подход может предотвратить развитие ожирения сопутствующие заболевания, такие как тип 2 диабет и сердечно-сосудистых заболеваний.
Этот документ описывает изоляции, расширение и дифференциации белых и бежевых адипоцитов из подмножества жировых тканях человека эндотелиальных клеток, которые совместно Экспресс CD31 и CD34 маркеров. Метод является относительно дешевым и не является трудоемким. Она требует доступа к человека жировой ткани и подкожные депо подходит для выборки. Для этого протокола, свежие жировой ткани образцов из morbidly ожирением предметы [индекс массы тела (ИМТ) > 35] собраны во время процедур бариатрической хирургии. Использование последовательных immunoseparation стромальные сосудистой фракции, достаточно клетки производятся из всего лишь 2-3 g жира. Эти клетки могут быть расширены в культуре в течение 10-14 дней, может быть криоконсервированных и сохраняют свои свойства адипогенном с пассированый до прохождения 5-6. Клетки обрабатываются в течение 14 дней с адипогенном коктейль, используя сочетание человеческого инсулина и PPARγ агонист Росиглитазон.
Эта методология может использоваться для получения доказательство концепции экспериментов на молекулярные механизмы, которые управляют адипогенном ответы в жировых клетках эндотелия, или для скрининга новых лекарств, которые могут повысить адипогенном ответ направлена либо на белый или бежевый/коричневый Адипоцит дифференциации. С помощью небольших подкожной биопсий, эта методология может использоваться для экрана-ответчик предметам для клинических испытаний, направленных на стимулирование бежевый/коричневый и белый адипоциты для лечения ожирения и сопутствующие заболевания.

Наш протокол направлен на обеспечение в vitro подход для определения адипогенном потенциал CD34 + CD31 + сосудистой клетки из разных депо жировых тканях человека. Упрощенная схема схема изображена на рисунке 1A. Первый шаг, используя положительный выбор CD...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue at JoVE.com

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Дифференциация белых и бежевых адипоцитов из жировой ткани сосудистой прародителями медведи потенциал повышения метаболизма ожирения. Мы описываем протоколы для CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток изоляции из человеческого жира и последующих в vitro расширения и дифференцировку в белом и бежевом адипоцитов. Обсуждаются несколько нисходящие приложения.

Изоляция, расширение и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от человека сальниковый и подкожной жировой ткани

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

This method can help answer key questions in the obesity field, such as identifying the key factors and mechanisms that prevent a robust adipogenic response during adipose tissue remodeling. The main advantage of this technique is that it allows isolation of CD34+CD31+endothelial cells from human adipose tissue starting with small amounts of tissue. We first had the idea for this method when we wanted to identify cells in human adipose vasculature that respond to adipogenic stimulation.Visual demonstration of this method is critical, as the cell isolation steps are difficult to practice due to the oftentimes limited access to fresh human adipose tissue. Collect human omental and subcutaneous adipose tissue from human subjects undergoing bariatric surgery. Immediately after tissue extraction, keep the human omental and subcutaneous adipose tissue in separate vials containing Hank's buffered salt solution with 50 micrograms per milliliter of penicillin streptomycin at room temperature.Once the sample arrives at the lab after the tissue extraction, carefully clean and remove fibrotic and cauterized sections of the tissue by using 70%ethanol-swabbed scissors and tweezers. Weigh the adipose tissue and partition it into five gram aliquots for the collagenase digestion. Use two pairs of scissors to finely mince five grams of the adipose tissue in five milliliters of a collagenase solution in a scintillation vial at room temperature.Add an additional 10 milliliters of collagenase solution to the minced tissue for 15 milliliters total. Digest the samples for one hour at 37 degrees Celsius in a water bath with continuous shaking. Following digestion, pour the samples into the 20 milliliter blunt end syringe.Filter the sample through 250 micron nylon mesh into the 50 milliliter conical tube to separate adipocytes and stromal vascular cells from undigested tissue. Wash out the scintillation vial with 10 milliliters of KRBBS, and pour the wash through the filter to collect residual cells before incubating the filtered samples for five minutes at room temperature. Then, utilize a 20 milliliter syringe and a 20 gauge by six inch pipetting needle to remove stromal vascular fraction layer and transfer it to a clean 50 milliliter conical tube.Add 10 milliliters of KRBBS and allow the samples to sit on the bench for five minutes at room temperature. Keep the stromal vascular fractions from both depots on ice for further processing. Spin the stromal vascular fractions at 500 times G for five minutes at 4 degrees Celsius.Remove the samples from the centrifuge and carefully pour off the supernatant, keeping the pellet containing the stromal vascular fraction cells. Gently re-suspend the cell pellets in five milliliters of PBS. After spinning the samples again, remove the supernatant, re-suspend the cells in one milliliter of PBS, and count the cells.Pellet the samples for a third time, and re-suspend the pellet in 100 microliters of CD34 isolation buffer. Add 10 microliters of CD34 cocktail and incubate the sample for 15 minutes at room temperature. Then add five microliters of magnetic beads and incubate the sample for 10 minutes at room temperature.Next, add 2.5 milliliters of CD34 isolation buffer to each sample, and place the samples into the magnet for five minutes at room temperature. Invert the magnet for five seconds to pour off the isolation buffer. After repeating this process four times, remove the tube from the magnet and add two milliliters of CD34 isolation buffer.Following another centrifugation, re-suspend the CD34+cell pellets in one milliliter of CD34 isolation buffer and count the cells. Pellet the cells again, and re-suspend the pellet in 250 microliters of Buffer B and 250 microliters of wash buffer. Next, thoroughly re-suspend the CD31 beads by vortexing the tube, then add 20 microliters of CD31 beads to the re-suspended cell pellet and incubate the sample with rocking for 30 minutes at room temperature.Prior to the cell separation, add one milliliter of wash buffer to equilabrate the strainer. Then, apply the prepared mixture of re-suspended cells in CD31 beads to the strainer. Wash the strainer with five milliliters of wash buffer in a circular motion for a total volume of 20 milliliters.Attach the connector to a sterile 50 milliliter conical tube and close the leur lock. After attaching the strainer to the connector, add one milliliter of wash buffer along the wall of the strainer, then add one milliliter of activated Buffer D along the wall of the strainer. Swirl the sample gently, and incubate it for 10 minutes at room temperature.Next, add one milliliter of wash buffer and separate the cells from the beads by pipetting up and down 10 times. Open the leur lock and allow the detached cells to flow into the 50 milliliter conical tube. Wash the strainer 10 times with one milliliter of wash buffer each time.Discard the connector and strainer, and centrifuge the samples at 300 times G for 10 minutes at 4 degrees Celsius. Finally, re-suspend the cell pellet in two milliliters of complete EGM2 media for culture. Grow the cells in six-well tissue culture treated plates with complete EGM2 media in a 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide incubator.Replace the media every three to four days until the cells reach 80 to 90%confluence. Then, seed approximately 100 to 200 thousand cells into six-well plates, ensuring duplicate wells for each depot, and culture them in complete EGM2 media for two days. After two days, aspirate off any growth media.Replace the media with two milliliters of DMEM/F-12 media with 5%FBS and 50 micrograms per milliliter of penicillin streptomycin for the control cells. For the treatment cells, replace the media with two milliliters of adipogenesis media. Incubate the cells at 37 degrees Celsius in a humidified 5%carbon dioxide incubator for 13 days replacing the respective media every three to four days.Representative results showing the typical endothelial cobblestone-like morphology of the CD34+CD31+cells after two passages in culture is shown. Also demonstrated is the ability of cells to form tubules when cultured in Matrigel as expected. Uniform uptake of fluorescently labeled acetylated LDL shows the presence of a homogenous cell population with endothelial identity.Shown here is Oil Red O staining of neutral lipid droplets in CD34+CD31+cells following 13 days of adipogenic induction. Representative responses of cells from omental and subcutaneous depots of three different human subjects are shown to illustrate the large variability in response to adipogenic induction between fat depots of the same donor and between donors. This image displays fluorescent intracellular lipid staining in CD34+C31+cells after adipogenic induction for 13 days.The image shows cells with unilocular lipids, multilocular lipids, and no lipid accumulation. Real time PCR shows the expression of the pan adipocyte marker adiponectin and the brown beige markers CIDEA and UCP-1. These results confirm that cells following adipogenic induction express molecular markers consistent with a mixed white beige adipocyte phenotype.Once mastered, this technique can be done in five hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it is important to remember to use fresh human adipose tissue that was collected and not stored longer than two hours. Following this procedure, other methods like flow cytometry, immunohistochemistry, and RT-PCR can be performed to identify specific subsets of responding cells, and expression of mature adipocyte markers that can be utilized to identify a beige brown adipocyte phenotype.After it's development, this technique paved the way for researchers in the filed of obesity to explore roles of adipose tissue, vascular cells, and adipogenesis in humans. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate, culture, and expand CD34+31+cells. Don't forget that working with human tissues can be extremely hazardous, and precautions, such as bio-safety regulations, should always be taken while performing this procedure.The implications of this technique extend toward therapy of obesity associated comorbidities, such as insulin resistance, because it identifies adipogenic response of cells to a potential therapeutic intervention.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Расширение, очистки и функциональной оценки периферической крови человека клетки NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

Расширение периферической крови человека γδ T клеток с использованием Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток и их использование в изучении нейтрофилов Переселение в проточных условиях

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Изоляция жировой ткани иммунных клеток

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Выделение вирусной репликации отсек обогащенных субъядерных фракций из аденовируса-инфицированных клетках человека нормальный

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Оценка синаптических интерфейса первичного человека Т-клеток в периферической крови и лимфоидной ткани

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Изоляция макрофагов и стромальных клеток от миокарда человека и мыши

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Пневмококк инфекция первичных эндотелиальных клеток человека в постоянном потоке

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...