Name: defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

الكتاب ممتن رادزينسكي ميتال لبلدها مناقشات مفيدة والحرج من قراءة المقالة، وباتريك غريفين وله أعضاء مختبر لمساعداتها غير محدود أثناء تأسيس منصة تحليل HDX. الكتاب ممتنون للمؤسسة الألمانية لإسرائيل (I-2332-1149.9/2012)، ومؤسسة العلوم ثنائية (2015056)، منح التكامل ماري كوري (618806)، "المؤسسة" للعلوم في إسرائيل (1765/13 و 2629/16)، و "علم الحدود البشرية" برنامج (CDA00064/2014) لتقديم الدعم المالي.

1. إعداد بروتينات مخفضة تماما والمؤكسدة تماما
<ol><li>
إعداد البروتين الكامل مخفضة ملاحظة: هنا، يمكننا وصف الحد من البروتينات التي تحتوي على الزنك، واستخدام زنكل2 الحل لاستعادة حالة البروتين أدرج الزنك، وانخفاض. يمكن الاستعاضة عن حل2 زنكل أو إهمالها. ملاحظة أن الوقت ود?...

في هذه الورقة، قدمنا البروتوكولات لتحليل النشاط وصي تعتمد على الأكسدة والاختزال وتوصيف التغيرات الهيكلية على ربط بروتين العميل. هذه منهجيات متكاملة لتحديد المجمعات وصي-الركيزة المحتملة وتحليل مواقع التفاعل المحتملة.
هنا، قمنا بتطبيق هذه البروتوكولات لتحديد خصائص معقدة ?...

وكثيراً ما تواجه الخلايا تراكم للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) أنتجت كمشتقات التنفس1،2، والبروتين والدهن الأكسدة3،4عمليات إضافية5، 6،7. على الرغم من روس بدور مفيد في العمليات البيولوجية المتنوعة مثل الخلوية مما يشير إلى8،9 والاستجابة المناعية10، اختلالاً في التوازن بين إنتاج روس وعن إزالة السموم قد تحدث، مما يؤدي إلى الأكسدة نشدد على7. البيولوجية وتستهدف روس بالبروتينات والدهون والأحماض النووية، أكسدة التي تؤثر في هيكل ووظيفة. ولذلك، تراكم الأكسدة الخلوية يرتبط ارتباطاً قويا بمجموعة متنوعة من الأمراض بما فيها السرطان9،11و12،التهاب13والشيخوخه14، 15، وتم العثور على أن تشارك في ظهور وتطور اضطرابات الأعصاب مثل الزهايمر، باركنسون في والمرض المرض16،،من1718.
البروتينات المركبة حديثا والناضجة حساسة للغاية للأكسدة بسبب التعديلات التي يمكن أن تكون ضارة بهم سلاسل جانبية، والتي تحدد شكل البروتين هيكل ووظيفة19،20. ولذلك، عادة ما يؤدي الأكسدة إلى المنظمة البروتين على نطاق واسع، ميسفولدينج والتجميع، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا. واحدة من استراتيجيات الخلوية أنيقة للتعامل مع الأضرار المحتملة لأكسدة البروتين هو استخدام مرافقين تعتمد على الأكسدة والاختزال، التي تحول دون تجميع البروتين على نطاق واسع، بدلاً من تشكيل مجمعات مستقرة مع العميل تجمعات بروتينات21 ،،من2223. يتم تنشيط هذه مرافقين الدفاع السطر الأول سريعاً من أكسدة الخاصة بالموقع (عادة على بقايا السيستين) الذي يحول منها إلى قوية مناهضة تجميع جزيئات24. منذ الأكسدة ينتج في تثبيط التنفس وحدوث انخفاض في مستويات ATP الخلوي25، المتعارف عليه تعتمد على ATP المحرمين أقل فعالية خلال الأكسدة الشروط25،26 ،27. ولذلك، مرافقين مستقلة ATP تنشيط الأكسدة تلعب دوراً حيويا في الحفاظ على التوازن البروتين عند تراكم المؤكسدات في البكتريا، وحقيقيات النوى (مثلاً، Hsp3328 و رضا29 في البكتيريا، Get330 في الخميرة، بيروكسيريدوكسينس31 في حقيقيات النوى). نشاط هذه مرافقين تعتمد اعتماداً كبيرا على عكسها التغييرات conformational الهيكلية الناجمة عن طريق أكسدة خاصة بالموقع أن يكشف مسعور المناطق المعنية في الاعتراف بالبروتينات العميل تجمعات.
البحث الآلية المضادة التجميع والمبادئ التي تحكم الاعتراف بالبروتينات العميل بمرافقين ليست سهلة نظراً لطبيعة ديناميكية واختلاف الركازة وصي التفاعلات32،33، 34،35،،من3637. لكن مرافقين الإجهاد-وينظم فرصة لتعزيز فهمنا لدالة تجميع المضادة نظراً لقدرتها على: 1) الحصول على شكلين مختلفين وصي ونشط (مثلاً، تتأكسد) وغير نشط (مثلاً، تخفيض)، مع إدخال أو إزالة حالة الإجهاد بسهولة التبديل بينهما (مثلاً، والأكسدة وعامل تخفيض) 2) لديها مجموعة واسعة من ركائز، 3) تشكل مجمعات مستقرة جداً مع البروتينات العميل التي يمكن تقييمها من قبل منهجيات مختلفة الهيكلي، و 4) تركز فقط على الاعتراف الركيزة والإفراج، توسط التغييرات conformational تعتمد على الأكسدة والاختزال، كما غالبية هذه مرافقين تفتقر إلى القدرة قابلة للطي.
وهنا، نحن نحلل وصي ينظم الأكسدة البكتيرية في Hsp33 للتجميع لمكافحة النشاط، عنصرا حيويا في نظام الدفاع الجرثومي ضد الناجمة عن أكسدة البروتين تجميع28. عند تصغير، Hsp33 بروتين ملزمة الزنك مطوية محكم مع أي نشاط وصي؛ ومع ذلك، عندما تتعرض للأكسدة، يخضع Hsp33 التغييرات conformational واسعة النطاق التي تعرض لها الركازة ربط مناطق38،39. أيون الزنك مرتبط بشدة بأربعة بقايا سيستين عاليا المصانة المجال ج-الطرفية عند الأكسدة، تم إصدارها40. هذه النتائج في تشكيل ثنائي كبريتيد اثنين السندات، تتكشف المجال C--المحطة الطرفية، وزعزعة استقرار المنطقة المتاخمة رابط41. المناطق الطرفية ج ورابط مرنة للغاية وتعرف بأنها جوهريا أو جزئيا اضطرابه. عند العودة إلى ظروف غير الإجهاد، تصبح انخفض سيستينيس والوصيفة يعود إلى حالته المطوية الأصلية مع أي نشاط المضادة تجميع. ريفولدينج الوصيفة يؤدي إلى كذلك تتكشف وزعزعة الاستقرار من البروتين عميل منضم، الذي يشغل نقله إلى نظام متعارف عليه والوصيفة، دناك/ي، ريفولدينج38. يوحي تحليل مواقع التفاعل Hsp33 لأن Hsp33 يستخدم كلا اضطرابه مشحونة المنطقتين، فضلا عن مناطق مسعور على رابط والمجال الطرفي ن لالتقاط تجمعات بروتينات العميل ومنع التراكم على38، 42-في الدولة مطوية، هذه المناطق تكون مخفية بواسطة رابط مطوية والمجال ج--المحطة الطرفية. من المثير للاهتمام، كمنطقة رابط برنامج حماية البوابة Hsp33 لدولة مطوية وغير نشط، "الاستشعار" حالة ج-الطرفية المتاخمة المجال34قابلة للطي. مرة واحدة تؤدي إلى زعزعة الطفرات (أما عن طريق طفرة نقطة أو اضطراب تسلسل كامل)، يتم تحويل Hsp33 إلى كوصي active مؤثرا بغض النظر عن حالة الأكسدة والاختزال في سيستينيس حساسة للأكسدة43.
تسمح البروتوكولات المقدمة هنا رصد وصي الأكسدة والاختزال-تعتمد على النشاط في Hsp33، فضلا عن تعيين التغييرات conformational عند التفعيل وملزمة للعميل البروتينات. هذه المنهجية يمكن تكييفها للبحوث وصي-العميل التعرف على النماذج الأخرى، فضلا عن تفاعلات البروتين البروتين غير وصي. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم البروتوكولات للتحضير لمرافقين تماما مخفضة والمؤكسدة التي يمكن استخدامها في الدراسات المتعلقة بالبروتينات الأكسدة والاختزال-التبديل الأخرى، للكشف عن الأدوار المحتملة لأكسدة البروتين على نشاط البروتين.
على وجه التحديد، يمكننا وصف إجراء لرصد وصي النشاط في المختبر وتحديد خصوصيته الركازة تحت أنواع مختلفة من تجميع البروتين (كيميائيا أو حرارياً المستحث) تشتت الضوء (LS) تقاس باستخدام فلوروسبيكتروميتير44. أثناء التجميع، على ضوء تشتت في زيادات nm 360 سريعاً بسبب تعكر متزايد. وهكذا، يمكن رصد التجميع بطريقة تعتمد على الوقت على هذا الطول الموجي. ليرة سورية طريقة سريعة وحساسة لاختبار وتجميع البروتين وهكذا نشاط التجميع المضادة بروتين اهتمام باستخدام تركيزات nanomolar، تمكين توصيف البروتين المتصلة بتجميع معلمات الحركية تحت مختلف شروط. وعلاوة على ذلك، البروتوكول LS الموصوفة هنا لا تتطلب أجهزة مكلفة، ويمكن أن ينشأ بسهولة في أي مختبر.
ومع ذلك، تحد كبير للحصول على منحنيات الحركية "نظيفة" وأن تستمد معلمات نسبة البروتين الحركية الخفيفة مثل نثر التجارب، بسبب الضوضاء وعدد كبير من القيم المتطرفة التي تم إنشاؤها بواسطة فقاعات الهواء ومجاميع كبيرة. للتغلب على هذه العقبة، نقدم الرواية أداة رسومية، كفيتس45، تستخدم للحد من مستويات الضوضاء في المقاييس الحركية المختلفة، المجهزة خصيصا للبروتين تجميع البيانات الحركية. توفير معلمات الحركية الأولية لتقييم أولى للنتائج هذا البرنامج ويسمح للمستخدم "تنظيف" كميات كبيرة من البيانات بسرعة دون التأثير على الخصائص الحركية الخاصة به. و كفيتس المنفذة في بايثون والمتاحة في المصادر المفتوحة في 45.
واحد من الأسئلة الصعبة في المجال يتصل برسم خرائط مواقع التفاعل بين مرافقين والبروتينات على العميل وفهم كيفية التعرف مرافقين مجموعة واسعة من ركائز تجمعات. هذا السؤال يزداد تعقيداً عند دراسة دينامية عالية البروتين المجمعات التي تنطوي في جوهرها اضطرابه مرافقين وركائز المعرضة للتجميع. لحسن الحظ، الكتلي الهيكلية تقدما هائلا على مدى العقد الماضي، ونجحت في تقديم نهج مفيدة وأدوات تحليل اللدونة الهيكلية ورسم خريطة للمخلفات تشارك في البروتين الاعتراف46، 47 , 48 , 49-نقدم هنا، واحد هذه تبادل تقنية-الهيدروجين-الديوتريوم الكتلي (HDX-MS)-الذي يسمح رسم خرائط للتغيرات في مستوى بقايا في تكيف هيكلي عند تعديل البروتين أو بروتين/يجند ملزمة35، 50،،من5152،53،،من5455. HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد يستخدم التبادل المستمر للهيدروجين العمود الفقري بالديوتريوم، معدل الذي يتأثر بالبيئة الكيميائية، وإمكانية الوصول إليها، والتساهميه وسندات غير تساهمية56. HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد المسارات عمليات الصرف هذه باستخدام مذيب الديوتيريوم، عادة الماء الثقيل (د2س)، ويسمح قياس استناداً إلى التغير في الوزن الجزيئي بعد الهيدروجين إلى تبادل الديوتريوم. يمكن أن يؤدي تباطؤ معدلات تبادل الهيدروجين الديوتريوم من الهيدروجين المشاركة في السندات الهيدروجين، أو ببساطة، من عائق الفراغية، التي تشير إلى التغييرات المحلية في هيكل57. التغييرات عند ربط يجند أو تعديلات بوستترانسلاشونال يؤدي أيضا إلى الاختلافات في البيئة الهيدروجين، مع ربط أدى إلى اختلافات في46،أسعار الصرف (HDX) الهيدروجين الديوتريوم53.
قمنا بتطبيق هذه التكنولوجيا إلى المناطق 1) خريطة Hsp33 التي تتكشف عند الأكسدة، مما يؤدي إلى تنشيط Hsp33، بسرعة و 2) تعريف واجهة الملزمة المحتملة من Hsp33 مع أن الركازة تجمعات كاملة الطول، سترات synthase (CS)38.
يمكن تطبيق الأساليب الموصوفة في هذه المخطوطة دراسة الوظائف المعتمدة على الأكسدة والاختزال للبروتينات في المختبر، تعريف النشاط المضادة التجميع ودور التغيرات الهيكلية (أن وجدت) في وظيفة البروتين. يمكن تكييفها لمختلف النظم البيولوجية هذه المنهجيات بسهولة وتطبيقها في المختبر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1588px;" width="1588">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Chemicals, Reagents</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Acetonitrile HPLC plus</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34998-2.5L</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Methanol</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">76-05-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Water for HPLC</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnCl2, Zinc Chloride</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B0755416 308</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT</td>
			<td>goldbio</td>
			<td>27565-41-9</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PD mini trap G-25 columns GE healthcare</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-9180-07</td>
			<td>desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Phosphate</td>
			<td>United states Biochemical Corporation</td>
			<td>20274</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K46809910526</td>
			<td>oxidizing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">citrate synthase</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3260</td>
			<td>substrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES acid free</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7365-45-9</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gndcl</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3272-500G</td>
			<td>denaturant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Chloride Solution</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">543047-10G</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Oxide 99%</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">151882-100G</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td style="width:256px;">bioworld</td>
			<td style="width:119px;">42000058-2</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">150uL Micro-Insert with Mandrel Interior &#38; Polymer Feet, 29*5mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quartz cuvette</td>
			<td style="width:256px;">Hellma 101-QS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Instruments</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Jasco FP-8500 Fluorospectrometer</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:256px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13058/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">pH meter , PB-11 sartorius</td>
			<td style="width:256px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">13119/0</td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).</td>
			<td style="width:256px;">AffiPro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td>
			<td style="width:256px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door</td>
			<td style="width:256px;">COY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Q-exactive-orbitrap mass spectrometer</td>
			<td style="width:256px;">Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples</td>
			<td style="width:256px;">PAL system</td>
			<td colspan="2">https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex Ultimate 3000, XRS pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex AXP-MS auxiliary pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Software, Software Tools, Database search</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Kfits: Fit aggregation Data</td>
			<td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermo Scientific Xcalibur software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td>
			<td style="width:256px;">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Chronos software (Axel Semrau)</td>
			<td style="width:256px;">http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteome Discoverer V1.4 software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HDX workbench software</td>
			<td colspan="3">http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

الكائنات الحية بانتظام بحاجة إلى التكيف مع البيئات المتغيرة خلال دورة حياتها، بما في ذلك التغيرات في درجة الحرارة ودرجة الحموضة، التراكم للأنواع الأكسجين التفاعلية، وأكثر. هذه التقلبات يمكن أن يؤدي لبروتين على نطاق واسع التي تتكشف، التجميع، وموت الخلية. ولذلك، تطورت الخلايا شبكة دينامية والإجهاد على حدة من مرافقين الجزيئية، التي تحافظ على البروتين "بصحة جيدة" خلال ظروف الإجهاد. المحرمين ATP مستقلة تشكل فئة رئيسية واحدة من مرافقين الجزيئية، التي تخدم كجزيئات الدفاع السطر الأول، حماية ضد تجميع البروتين بطريقة تعتمد على الإجهاد. هذه مرافقين تشترك في سمة واحدة هي قدرتها على الاستفادة من اللدونة الهيكلية للتنشيط الخاصة بالإجهاد، والاعتراف بها، والإفراج عن العميل تجمعات.
في هذه الورقة، ونحن نركز على تحليل واحد وصي اضطرابه جوهريا هذه، Hsp33 ينظم الأكسدة البكتيرية، التي تحمي البروتينات ضد التجميع خلال الأكسدة الوظيفية والهيكلية. هنا، نحن نقدم مجموعة أدوات تقنيات متنوعة لدراسة النشاط ينظم الأكسدة وصي، فضلا عن تعيين التغييرات conformational من الوصيفة، الكامنة وراء نشاطها. على وجه التحديد، يمكننا وصف سير عمل الذي يشمل الإعداد البروتينات مخفضة تماما والمؤكسدة تماما، يليها تحليل وصي التجميع لمكافحة النشاط في المختبر باستخدام تشتت الضوء، مع التركيز على الدرجة التجميع لمكافحة نشاط وحركية لها. للتغلب على كثرة القيم المتطرفة المتراكمة خلال فحوصات التجميع، يصف لنا استخدام كفيتس، أداة رسومية رواية التي تتيح معالجة سهلة للقياسات الحركية. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأداة إلى أنواع أخرى من المقاييس الحركية لإزالة القيم المتطرفة والمناسب معلمات الحركية. لربط الدالة مع هيكل البروتين، يصف لنا بالإعداد وسير عمل تقنية الهيكلية الكتلي، الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي، التي تسمح برسم خرائط للتغيرات كونفورماشونال على الوصيفة و الركيزة خلال مراحل مختلفة من النشاط Hsp33. يمكن تطبيق نفس المنهجية لتفاعلات البروتين البروتين والبروتين-يجند أخرى.

أسلوبي عرض تجعل من الممكن لمتابعة النشاط الحركي وديناميات تفاعلات البروتين بين كوصي وعلى الركازة. وعلاوة على ذلك، يسمح بروتوكول الحد من أكسدة إعداد كوصي انخفاض تماما والمؤكسدة تماما، إعطاء فهم أكثر عمقاً لتفعيل إليه من مرافقين اضطرابه تعتمد على الأكسدة والاختزال.
<p cl...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

واحد من شروط الضغط الأكثر تحديا التي تواجهها الكائنات الحية خلال حياتهم ينطوي على التراكم للتأكسد. خلال الأكسدة، خلايا تعتمد بشدة على مرافقين الجزيئية. نقدم هنا، الأساليب المستخدمة في التحقيق ينظم الأكسدة التجميع المضادة النشاط، وكذلك فيما يتعلق برصد التغيرات الهيكلية التي تنظم وظيفة وصي باستخدام HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد.

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...