Name: defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Forfatterne er taknemlig hen til Meytal Radzinski for hendes nyttige diskussioner og kritiske læsning af artiklen og Patrick Griffin og hans lab medlemmer for deres ubegrænset hjælp mens etablere HDX analyse platform. Forfatterne er taknemmelige for den tysk-Israel Foundation (I-2332-1149.9-2012), binationale Science Foundation (2015056), Marie Curie-integration grant (618806), Israel Science Foundation (1765/13 og 2629/16), og Human Frontier Science Program (CDA00064/2014) for deres finansielle støtte.

1. forberedelse af fuldt reduceret og fuldt oxideret proteiner
<ol><li>
Forberedelse af en fuldt reduceret protein Bemærk: Her, vi beskriver reduktion af en zink-holdige proteiner, og brug en ZnCl2 løsning til at gendanne tilstanden Zn-indarbejdet, reduceret protein. ZnCl2 løsning kan udskiftes eller kasseres. Bemærk, at tid og temperatur reduktion proces afhænger af protein stabilitet og funktion, og er dermed bestemt pr. protein.<ol>
<li>Tø protein prøven på is og spi...

I dette papir givet vi protokoller for analyse af aktivitet i redox-afhængige anstandsdame og karakterisering af strukturelle ændringer på bindingen af en klient protein. Disse er komplementære metoder til at definere potentielle anstandsdame-substrat komplekser og analysere potentielle samspil websteder.
Her, vi har anvendt disse protokoller til karakterisering af en kompleks mellem den redox-regulerede anstandsdame Hsp33 med velundersøgte anstandsdame substrat CS. Vi præsenteret to for...

Celler støder ofte på en ophobning af reaktive ilt arter (ROS) produceret som biprodukter af respiration1,2, proteiner og lipid oxidation3,4, og yderligere processer5, 6,7. Trods ROS' gavnlig rolle i forskellige biologiske processer såsom cellulær signalering8,9 og immunrespons10, kan en ubalance mellem ROS produktion og dets afgiftning forekomme, fører til oxidativ understrege7. De biologiske mål af ROS er proteiner, lipider og nukleinsyrer, oxidation af som påvirker deres struktur og funktion. Derfor er ophobning af cellulære oxidanter stærkt knyttet til en række forskellige sygdomme herunder kræft9,11, betændelse12,13, og aging14, 15, og er blevet fundet for at være involveret i starten og progression af neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers, Parkinsons og ALS sygdom16,17,18.
Både nyligt syntetiserede og modne proteiner er meget følsom over for oxidation på grund af de potentielt skadelige ændringer af deres sidekæder, der former protein struktur og funktion19,20. Derfor fører oxidativt stress som regel til en udbredt protein inaktivering, misfoldning og sammenlægning, i sidste ende fører til celledød. En af de elegante cellulære strategier til at håndtere de potentielle skader af protein oxidation er at udnytte redox-afhængige chaperoner, som hæmmer udbredt protein sammenlægning, i stedet for at danne stabile komplekser med fejlfoldede klient proteiner21 ,22,23. Disse første linje forsvar chaperoner aktiveres hurtigt ved en lokationsspecifik oxidation (normalt på cystein restkoncentrationer), der konverterer dem til potente anti-sammenlægning molekyler24. Da oxidativt stress resulterer i hæmning af respiration og i fald i cellulære ATP niveauer25, er kanoniske ATP-afhængige chaperoner mindre effektive under oxidative stress betingelser25,26 ,27. Derfor, redox-aktiveret ATP-uafhængig chaperoner spiller en afgørende rolle i at opretholde protein homøostase ved ophobning af oxidanter i bakterier og eukaryoter (fx, Hsp3328 og RidA29 i bakterier, Get330 i gær, peroxiredoxins31 i eukaryoter). Aktiviteten af disse chaperoner afhænger kraftigt reversible konformationelle strukturændringer fremkaldt af en lokationsspecifik oxidation, der afdækker hydrofobe regioner involveret i anerkendelse af fejlfoldede klient proteiner.
Forskning af den anti-sammenlægning mekanisme og principperne for anerkendelse af klient proteiner af chaperoner er ikke let følge af anstandsdame-substrat interaktioner32,33, dynamisk og heterogenic 34,35,36,37. Stress-regulerede chaperoner har dog mulighed for at fremme vores forståelse af den anti-akkumuleringsfunktion på grund af deres evne til at: 1) få to forskellige former af den anstandsdame, aktiv (fxoxideret) og inaktive (f.eks. reduceret), med introduktion eller fjernelse af en stress tilstand let skifte mellem dem (f.eks., oxidant og reduktionsmiddel), 2) har en bred vifte af substrater, 3) danner meget stabile komplekser med klienten proteiner, som kan evalueres ved forskellige strukturelle metoder, og 4) fokusere udelukkende på substrat anerkendelse og frigivelse, medieret af redox-afhængige konformationelle ændringer, som fleste af disse chaperoner mangler folde kapacitet.
Her analyserer vi den bakterielle redox-regulerede anstandsdame Hsp33's anti-sammenlægning aktivitet, en vital komponent i den bakterielle forsvarssystem mod oxidation-induceret protein sammenlægning28. Når reduceret, er Hsp33 en stramt foldede zink-bindende protein med ingen anstandsdame aktivitet; men når de udsættes for oxidativt stress, Hsp33 undergår omfattende konformationelle ændringer, der udsætter sit Bæremateriale bindende regioner38,39. Ved oxidation er zinkion, der er stærkt bundet til fire meget bevaret cystein rester af domænet C-terminal frigivet40. Dette resulterer i dannelse af to disulfid obligationer, en udfoldelse af domænet C-terminal og en destabilisering af tilstødende linker region41. Regionerne C-terminal og linker er yderst fleksible og er defineret som uløseligt eller delvist uorganiseret. Efter tilbagevenden til ikke-stressforhold, cysteines blive reduceret og anstandsdame vender tilbage til sin oprindelige foldet tilstand med ingen anti-sammenlægning aktivitet. Hvorved man genfolder af anstandsdame fører til en yderligere udfoldelsen og destabilisering af bundne klient protein, der udløser sin overførsel til den kanoniske anstandsdame system, DnaK/J, for hvorved man genfolder38. Analyse af Hsp33's interaktion websteder tyder på, at Hsp33 bruger begge sine opladet uordnede regioner samt de hydrofobe regioner linker og N-terminale domæne til at fange fejlfoldede klient proteiner og forhindre deres akkumulering38, 42. i den foldede tilstand, disse regioner er skjult af den foldede linker og C-terminale domæne. Interessant, fungerer regionen linker som gatekeeper af Hsp33's foldede og inaktiv tilstand, "sensing" folde status af dets tilstødende C-terminale domæne34. Når destabiliseret af mutagenese (enten ved et punkt mutation eller en fuld sekvens undertrykkelse af netbårne), omdannes Hsp33 til et constitutively aktiv anstandsdame uanset redox tilstand af dens redox-følsomme cysteines43.
Protokollerne præsenteres her tillader overvågning af Hsp33's redox-afhængige anstandsdame aktivitet, samt kortlægning konformationelle ændringer efter aktivering og binding af klient proteiner. Denne metode kan tilpasses forskning andre anstandsdame-klient anerkendelse modeller samt ikke-anstandsdame protein-protein interaktioner. Desuden præsenterer vi protokoller til forberedelse af fuldt reduceret og oxideret chaperoner, der kan bruges i undersøgelser af andre proteiner, redox-switch, til at afsløre potentielle roller af protein oxidation på protein aktivitet.
Specifikt, vi beskriver en metode til at overvåge anstandsdame aktivitet in vitro- og definere sit Bæremateriale specificitet under forskellige typer af protein sammenlægning (kemisk eller termisk induceret) ved hjælp af lysspredning (LS) målt ved et fluorospectrometer44. Under sammenlægning, lys spredning på 360 nm stiger hurtigt på grund af den stigende turbiditet. Således, sammenlægning kan overvåges på en tidsafhængig måde ved denne bølgelængde. LS er en hurtig og følsom metode til afprøvning af protein sammenlægning og dermed anti-sammenlægning aktiviteten af et protein af interesse ved hjælp af nanomolar koncentrationer, gør det muligt for karakterisering af protein sammenlægning-relaterede kinetiske parametre under forskellige betingelser. Derudover LS protokollen beskrevet her kræver ikke dyrt instrumentering, og let kan etableres i alle laboratorier.
Det er dog ganske udfordrende at få "rene" kinetic kurver og at udlede et protein kinetiske parametre fra sådanne lys spredning eksperimenter, på grund af støj og det store antal outliers genereret af luftbobler og store aggregater. For at overvinde denne hindring, præsenterer vi en roman grafisk værktøj, Kfits45, anvendes for at reducere støjniveauet i forskellige kinetic målinger, specielt udstyret til protein sammenlægning kinetiske data. Denne software giver foreløbige kinetiske parametre for en tidlig vurdering af resultaterne og tillader brugeren at "rense" store mængder data hurtigt uden at påvirke dets kinetiske egenskaber. Kfits er implementeret i Python og tilgængelige i open source på 45.
En af de udfordrende spørgsmål i feltet vedrører kortlægning interaktion steder mellem chaperoneproteiner og deres klient proteiner og forstå, hvordan chaperoner genkende en bred vifte af fejlfoldede substrater. Dette spørgsmål er yderligere kompliceret, når studerer højdynamiske proteinkomplekser, der involverer uløseligt uordnede chaperoneproteiner og sammenlægning-tilbøjelige substrater. Heldigvis, strukturelle massespektrometri har dramatisk Avanceret i det sidste årti og har med held givet nyttige metoder og værktøjer til at analysere den strukturelle plasticitet og kortlægge restkoncentrationer involveret i protein anerkendelse46, 47 , 48 , 49. her, præsenterer vi en sådan teknik-brint-deuterium exchange massespektrometri (HDX-MS)-som giver mulighed for kortlægning af rest-niveau ændringer i en strukturel kropsbygning ved protein ændring eller protein/Ligand bindende35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS bruger kontinuerlig udveksling af rygraden brintatomer af deuterium, sats som er påvirket af det kemiske miljø, tilgængelighed og kovalente og kovalente bindinger56. HDX-MS spor disse exchange processer ved hjælp af en deutereret opløsningsmiddel, almindeligt tungt vand (D2O), og tillader måling baseret på ændringen i Molekylær vægt efter brint til deuterium exchange. Langsommere satser for brint-deuterium exchange kan skyldes brintatomer deltager i brint obligationer eller, simpelthen, fra sterisk hindring, som viser lokale ændringer i struktur57. Ændringer på en ligand bindende eller posttranslationelle modifikationer kan også føre til forskelle i brint-miljø med en bindende resulterer i forskelle i brint-deuterium exchange (HDX) satser46,53.
Vi anvendte denne teknologi til 1) kort Hsp33 regioner, som hurtigt udvikler sig ved oxidation, fører til aktivering af Hsp33, og 2) definerer den potentielle bindende grænseflade af Hsp33 med dens fuld længde fejlfoldede substrat, citrat syntase (CS)38.
De metoder, der beskrives i dette håndskrift kan anvendes til at studere redox-afhængige funktioner af proteiner i vitro, definere anti-sammenlægning aktivitet og rollen af strukturelle ændringer (hvis nogen) i protein funktion. Disse metoder kan let tilpasses til forskellige biologiske systemer og anvendes i laboratoriet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1588px;" width="1588">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Chemicals, Reagents</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Acetonitrile HPLC plus</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34998-2.5L</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Methanol</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">76-05-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Water for HPLC</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnCl2, Zinc Chloride</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B0755416 308</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT</td>
			<td>goldbio</td>
			<td>27565-41-9</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PD mini trap G-25 columns GE healthcare</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-9180-07</td>
			<td>desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Phosphate</td>
			<td>United states Biochemical Corporation</td>
			<td>20274</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K46809910526</td>
			<td>oxidizing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">citrate synthase</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3260</td>
			<td>substrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES acid free</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7365-45-9</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gndcl</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3272-500G</td>
			<td>denaturant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Chloride Solution</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">543047-10G</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Oxide 99%</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">151882-100G</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td style="width:256px;">bioworld</td>
			<td style="width:119px;">42000058-2</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">150uL Micro-Insert with Mandrel Interior &#38; Polymer Feet, 29*5mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quartz cuvette</td>
			<td style="width:256px;">Hellma 101-QS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Instruments</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Jasco FP-8500 Fluorospectrometer</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:256px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13058/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">pH meter , PB-11 sartorius</td>
			<td style="width:256px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">13119/0</td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).</td>
			<td style="width:256px;">AffiPro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td>
			<td style="width:256px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door</td>
			<td style="width:256px;">COY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Q-exactive-orbitrap mass spectrometer</td>
			<td style="width:256px;">Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples</td>
			<td style="width:256px;">PAL system</td>
			<td colspan="2">https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex Ultimate 3000, XRS pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex AXP-MS auxiliary pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Software, Software Tools, Database search</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Kfits: Fit aggregation Data</td>
			<td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermo Scientific Xcalibur software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td>
			<td style="width:256px;">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Chronos software (Axel Semrau)</td>
			<td style="width:256px;">http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteome Discoverer V1.4 software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HDX workbench software</td>
			<td colspan="3">http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

Levende organismer skal jævnligt håndtere svingende miljøer i løbet af deres livscyklus, herunder ændringer i temperatur, pH, ophobning af reaktive ilt arter og meget mere. Disse udsving kan føre til en udbredt protein udfoldning, sammenlægning, og celle død. Celler har derfor udviklet sig et dynamisk og stress-specifikke netværk af molekylære chaperoner, der opretholder en "sund" proteomet under stress betingelser. ATP-uafhængig chaperoner udgør en stor klasse af molekylære chaperoner, der tjener som første linje forsvar molekyler, beskyttelse mod protein sammenlægning i en stress-afhængige måde. En funktion disse chaperoner har tilfælles er deres evne til at udnytte strukturfondene plasticitet for deres stress-specifik aktivering, anerkendelse og frigivelse af fejlfoldede klient.
I dette papir fokuserer vi på den funktionelle og strukturelle analyse af en sådan uløseligt uordnede anstandsdame, den bakterielle redox-regulerede Hsp33, der beskytter proteiner imod sammenlægning under oxidativt stress. Vi præsenterer her, en værktøjskasse med forskellige teknikker for at studere redox-regulerede anstandsdame aktivitet og for kortlægning konformationelle ændringer af anstandsdame, ligger til grund for sin aktivitet. Specifikt, vi beskriver en arbejdsproces, der omfatter forberedelse af fuldt reduceret og fuldt oxideret proteiner, efterfulgt af en analyse af den anstandsdame anti-sammenlægning aktivitet in vitro- ved hjælp af lys-spredning, med fokus på graden af den anti-sammenlægning aktivitet og dens forsvindingskinetik. For at overvinde hyppige outliers akkumuleret under sammenlægning assays, beskriver vi brugen af Kfits, en roman grafisk værktøj, der giver mulighed for nem behandling af kinetic målinger. Dette værktøj kan let anvendes til andre typer af kinetic målinger for at fjerne outliers og montering kinetiske parametre. For at korrelere funktionen med protein struktur, vi beskriver opsætning og workflow af en strukturel massespektrometri teknik, brint-deuterium exchange-massespektrometri, der giver mulighed for kortlægning af konformationelle ændringer på anstandsdame og substrat i forskellige faser af Hsp33 aktivitet. Samme metode kan anvendes på andre protein-protein og protein-ligand interaktioner.

De to beskrevne metoder gør det muligt at følge den kinetiske aktivitet og dynamik af protein interaktioner mellem en anstandsdame og sit Bæremateriale. Derudover tillader reduktion-oxidation protokollen tilberedning af et fuldt reduceret og fuldt oxideret anstandsdame, at give en mere dybdegående forståelse af aktivering mekanisme af redox-afhængige uordnede chaperoner.
Først, vi brugte lysspredning for at undersøge ans...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definere Hsp33's Redox-regulerede anstandsdame aktivitet og kortlægning konformationelle ændringer på Hsp33 ved hjælp af brint-deuterium Exchange massespektrometri

En af de mest udfordrende stressforhold, at organismer støder på i løbet af deres levetid medfører ophobning af oxidanter. Under oxidative stress afhængige celler stærkt molekylære chaperoner. Vi præsenterer her, metoder, der anvendes til at undersøge den redox-regulerede anti-sammenlægning aktivitet, samt for at overvåge strukturelle ændringer vedrørende den anstandsdame funktion bruger HDX-MS.

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation for Kvantitativ massespektrometri Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestemmelse af Protease specificitet i mus væv ekstrakter af MALDI-TOF-massespektrometri: manipulere PH for at forårsage specificitet ændringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysere dynamisk proteinkomplekser samles på og frigivet fra Biolayer interferometri Biosensor ved hjælp af massespektrometri og elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En forberedelse til plasmaprøve til massespektrometri ved hjælp af en automatiseret arbejdsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...