Name: defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

De auteurs zijn Meytal Radzinski dankbaar voor haar nuttige discussies en kritische lezing van het artikel, en Patrick Griffin en zijn leden van de lab voor hun onbeperkte hulp nodig hebt bij de vaststelling van de HDX analyse platform. De auteurs zijn dank aan de Stichting Duits-Israël (I-2332-1149.9/2012), de Binationale Science Foundation (2015056), de Marie-Curie integratie grant (618806), de Israël Science Foundation (1765/13 en 2629/16), en het Human Frontier Science Programma (CDA00064/2014) voor hun financiële steun.

1. bereiding van volledig verminderde en volledig Geoxideerde proteïnen
<ol><li>
Voorbereiding van een volledig verlaagd eiwit Opmerking: Hier, beschrijven we de vermindering van een zinkhoudende eiwitten, en gebruik een ZnCl2 oplossing om te herstellen van de Braziliaanse Zn-opgenomen, minder eiwitten. De ZnCl2 oplossing kan worden vervangen of verwijderd. Merk op dat de tijd en de temperatuur van het proces van vermindering hangt af van de eiwitstabiliteit en functie, en is ...

In deze paper voorzien wij protocollen de analyse van de redox-afhankelijke chaperone activiteit en de karakterisatie van structurele veranderingen op de binding van een client-eiwit. Dit zijn de complementaire methoden potentiële chaperon-substraat complexen definiëren en analyseren van potentiële locaties van de interactie.
Hier, wij deze protocollen voor de karakterisering van een complex tussen de redox-gereglementeerde chaperone Hsp33 met een goed bestudeerde chaperone substraat CS toe...

Cellen tegenkomen vaak een opeenstapeling van reactieve zuurstof soorten (ROS) geproduceerd als bijproduct van de ademhaling1,2, eiwit en lipide oxidatie3,4en extra processen5, 6,7. Ondanks ROS gunstig rol in verschillende biologische processen zoals mobiele signalering van8,9 en immuunrespons10, kan een gebrek aan evenwicht tussen ROS productie en de ontgifting optreden, toonaangevende aan oxidatieve 7benadrukken. De biologische doelstellingen van ROS zijn eiwitten en lipiden, nucleïnezuren, de oxidatie van die invloed hebben op hun structuur en functie. Daarom is de accumulatie van cellulaire oxidanten sterk gekoppeld aan een breed scala aan ziektebeelden zoals kanker9,11, ontsteking12,13en veroudering14, 15, en hebben gevonden te worden betrokken bij het ontstaan en de progressie van neurodegeneratieve aandoeningen zoals Alzheimer, Parkinson van, en de ALS ziekte16,17,18.
Zowel nieuw samengestelde en volwassen eiwitten zijn zeer gevoelig voor oxidatie als gevolg van de potentieel schadelijke wijzigingen van hun zijketens, die vorm van eiwit structuur en functie19,20. Daarom leidt oxidatieve stress meestal tot een wijdverbreide eiwit geïnactiveerd, de misfolding en de aggregatie, uiteindelijk zal leiden tot celdood. Een van de elegante cellulaire strategieën om te gaan met de potentiële schade van eiwit oxidatie is te gebruiken van redox-afhankelijke chaperones, die de wijdverbreide eiwit aggregatie remmen, in plaats van het vormt stabiele complexen met misfolded client eiwitten21 ,22,23. Deze eerstelijns defensie chaperones worden snel geactiveerd door een sitespecifieke oxidatie (meestal op cysteïne residuen) dat in krachtige anti-aggregatie moleculen24 omgezet. Aangezien oxidatieve stress in de remming van de ademhaling en dalingen in de cellulaire ATP niveaus25 leidt, zijn canonieke ATP-afhankelijke chaperones minder effectief tijdens oxidatieve stress voorwaarden25,26 ,27. Daarom, redox-geactiveerde ATP-onafhankelijke chaperones spelen een cruciale rol bij het handhaven van de homeostase van het eiwit op de accumulatie van oxidanten in bacteriën en eukaryoten (b.v., Hsp3328 en RidA29 bij bacteriën, Get330 in gist, peroxiredoxins31 in eukaryoten). De activiteit van deze chaperones is sterk afhankelijk van omkeerbare structurele conformationele veranderingen geïnduceerd door een sitespecifieke oxidatie die hydrofobe regio's die betrokken zijn bij de erkenning van misfolded client eiwitten onthult.
Onderzoek van de anti-aggregatie-mechanisme en de beginselen inzake de erkenning van de client-eiwitten door chaperones is niet eenvoudig als gevolg van het dynamische en heterogenic karakter van de Chaperon-substraat interacties32,33, 34,35,,36,,37. Stress-gereglementeerde chaperones hebben echter een kans om ons begrip van de anti-aggregatie functie vanwege hun vermogen om: 1) verkrijgen van twee verschillende vormen van de Chaperon, actief (bijvoorbeeldgeoxideerd) en inactief (b.v. verminderd), met de invoering of de verwijdering van een aandoening van de stress gemakkelijk schakelen tussen hen (bv, oxidator en reducerende agent), 2) hebben een breed scala van substraten, 3) zeer stabiele complexen vormen met de client-eiwitten die kunnen worden geëvalueerd door verschillende structurele methodologieën, en 4) uitsluitend richten op het substraat erkenning en introductie, gemedieerd door redox-afhankelijke conformationele veranderingen, zoals de meerderheid van deze chaperones het vouwen vermogen ontbreekt.
Here, analyseren we de bacteriële redox-gereglementeerde chaperone Hsp33 van anti-aggregatie activiteit, een essentieel onderdeel van het bacteriële verdedigingssysteem tegen oxidatie-geïnduceerde proteïne aggregatie28. Wanneer verlaagd, is Hsp33 een strak gevouwen zink-bindend-proteïne met geen chaperone activiteit; echter wanneer blootgesteld aan oxidatieve stress, ondergaat Hsp33 uitgebreide conformationele veranderingen die haar substraat bindende regio's38,39blootstellen. Op oxidatie is het zink ion dat sterk aan vier zeer geconserveerde cysteïne residuen van het C-terminal domein gebonden is vrijgegeven40. Dit resulteert in de vorming van twee disulfide bindingen, een ontplooiing van de C-terminal domein, en een destabilisering van de aangrenzende linker regio41. De C-terminal en linker regio's zijn zeer flexibel en worden gedefinieerd als intrinsiek of gedeeltelijk ontregelde. Bij terugkeer naar niet-stress voorwaarden, de cysteines worden verminderd en de Chaperon keert terug naar zijn geboortestaat gevouwen met geen anti-aggregatie-activiteit. Het uiteinde van de Chaperon leidt tot een verdere ontplooiing en destabilization van de afhankelijke client proteïne, die de overdracht aan de canonieke chaperone systeem, DnaK/J, voor uiteinde38triggers. Analyse van de Hsp33 interactie sites suggereert dat Hsp33 gebruikt beide die zijn geladen ontregelde regio's, alsmede de hydrofobe regio's over het linker en het N-terminaal domein te vangen misfolded client eiwitten en voorkomen hun aggregatie38, dat 42. in gevouwen toestand, deze regio's zijn verborgen door de gevouwen linker en C-terminal domein. Interessant is dat fungeert de linker regio als poortwachter van Hsp33 van gevouwen en inactieve staat, "sensing" de opvouwbare status van de aangrenzende C-terminal domein34. Zodra gedestabiliseerd door mutagenese (hetzij door een mutatie van de punt of een volledige reeks perturbation), wordt Hsp33 geconverteerd naar een constitutively actieve chaperone ongeacht de redox staat van haar redox-sensitive cysteines43.
De hier gepresenteerde protocollen toestaan monitoring van Hsp33 de redox-afhankelijke chaperone activiteit, evenals de conformationele wijzigingen van de toewijzing na de activatie en binden van eiwitten van de client. Deze methode kan worden aangepast aan het onderzoek andere chaperon-client erkenning modellen evenals niet-chaperone eiwit-eiwitinteractie. Bovendien presenteren wij protocollen voor de bereiding van volledig gereduceerde en de geoxideerde chaperones die kunnen worden gebruikt in studies van andere redox-switch eiwitten, te onthullen van de potentiële rol van eiwit oxidatie op de activiteit van het eiwit.
Specifiek, beschrijven we een procedure om te controleren chaperone activiteit in vitro en definiëren van zijn substraat specificiteit uit hoofde van verschillende soorten eiwit aggregatie (chemisch of thermisch geïnduceerde) met behulp van de verstrooiing van licht (LS) gemeten door een fluorospectrometer44. Tijdens de samenvoeging, licht verstrooiing op 360 nm stijgt snel als gevolg van de toenemende turbiditeit. Zo kan aggregatie worden gecontroleerd op een tijd-afhankelijke manier bij deze golflengte. LS is een snelle en gevoelige methode voor het testen van de aggregatie van eiwitten en dus de activiteit van de anti-aggregatie van een proteïne van belang met behulp van nanomolar concentraties, waardoor de karakterisering van proteïne aggregatie-gerelateerde kinetische parameters onder verschillende voorwaarden. Bovendien, het LS-protocol beschreven hier vereist geen dure instrumentatie, en kan gemakkelijk worden vastgesteld in een laboratorium.
Het is echter vrij uitdagend om te verkrijgen 'schone' kinetische curven en voor het afleiden van een eiwit kinetische parameters van dergelijke licht verstrooiing experimenten, als gevolg van lawaai en het grote aantal uitschieters gegenereerd door luchtbellen en grote aggregaten. Om te overwinnen deze hindernis, presenteren we een nieuwe grafische tool, Kfits45, ter vermindering van de geluidsniveaus in de verschillende kinetische metingen, speciaal uitgerust voor eiwit aggregatie kinetische gegevens gebruikt. Deze software levert voorontwerp kinetische parameters voor een vroege evaluatie van de resultaten en staat de gebruiker toe om "schoon" grote hoeveelheden data snel zonder de kinetische eigenschappen. Kfits is geïmplementeerd in Python en beschikbaar in open source op 45.
Een van de uitdagende vragen op het gebied betreft aan sites van de interactie tussen chaperones en de proteïnen van hun cliënt in kaart te brengen en het inzicht hoe chaperones herkennen een breed scala van misfolded substraten. Deze vraag wordt nog ingewikkelder wanneer studeren hoogdynamische eiwitcomplexen waarbij intrinsiek chaperones en aggregatie-naar voren gebogen substraten ontregelde. Gelukkig, structurele massaspectrometrie dramatisch het laatste decennium heeft geavanceerde en heeft met succes nuttig benaderingen en hulpmiddelen voor het analyseren van de structurele plasticiteit en kaart van residuen die betrokken zijn bij eiwit erkenning46, 47 , 48 , 49. hier, presenteren we een dergelijke techniek-waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS)-waarmee de toewijzing van residuen wijzigingen in een structurele bevestiging bij wijziging van de proteïne of eiwit/Ligand bindende35, 50,51,52,53,,54,55. HDX-MS maakt gebruik van de voortdurende uitwisseling van ruggengraat waterstof door deuterium, het tarief van die wordt beïnvloed door de chemische milieu, toegankelijkheid, en covalente en niet-covalente bindingen56. HDX-MS deze exchange-processen met behulp van een Halfzwaar oplosmiddel, vaak zwaar water (D2van O) worden bijgehouden en kan waarderingsmethode op basis van de verandering in de moleculaire gewicht na het waterstof met deuterium exchange. Lagere tarieven van waterstof-deuterium exchange kunnen leiden tot van waterstof waterstofbruggen deelnemen of, gewoon, vanaf sterische hinder, waarin lokale wijzigingen in de structuur57. Wijzigingen op een ligand binding of posttranslationele modificaties kunnen het ook leiden tot verschillen in de omgeving van waterstof, met een bindende voortvloeiende verschillen in de waterstof-deuterium uitwisseling (HDX) tarieven46,53.
We deze technologie toegepast op 1) Hsp33 kaartregio die snel ontvouwen op oxidatie, wat leidt tot het activeren van Hsp33, en 2) het definiëren van de potentiële bindende interface van Hsp33 met zijn album misfolded substraat, citraat synthase (CS)38.
De methoden die worden beschreven in dit manuscript kunnen worden toegepast om te studeren redox-afhankelijke functies van eiwitten in vitro, definiëren van anti-aggregatie activiteit en de rol van structurele veranderingen (indien van toepassing) in eiwitfunctie. Deze methodologieën kunnen gemakkelijk worden aangepast aan uiteenlopende biologische systemen en toegepast in het laboratorium.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1588px;" width="1588">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Chemicals, Reagents</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Acetonitrile HPLC plus</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34998-2.5L</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Methanol</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">76-05-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Water for HPLC</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnCl2, Zinc Chloride</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B0755416 308</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT</td>
			<td>goldbio</td>
			<td>27565-41-9</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PD mini trap G-25 columns GE healthcare</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-9180-07</td>
			<td>desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Phosphate</td>
			<td>United states Biochemical Corporation</td>
			<td>20274</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K46809910526</td>
			<td>oxidizing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">citrate synthase</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3260</td>
			<td>substrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES acid free</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7365-45-9</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gndcl</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3272-500G</td>
			<td>denaturant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Chloride Solution</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">543047-10G</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Oxide 99%</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">151882-100G</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td style="width:256px;">bioworld</td>
			<td style="width:119px;">42000058-2</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">150uL Micro-Insert with Mandrel Interior &#38; Polymer Feet, 29*5mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quartz cuvette</td>
			<td style="width:256px;">Hellma 101-QS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Instruments</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Jasco FP-8500 Fluorospectrometer</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:256px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13058/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">pH meter , PB-11 sartorius</td>
			<td style="width:256px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">13119/0</td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).</td>
			<td style="width:256px;">AffiPro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td>
			<td style="width:256px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door</td>
			<td style="width:256px;">COY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Q-exactive-orbitrap mass spectrometer</td>
			<td style="width:256px;">Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples</td>
			<td style="width:256px;">PAL system</td>
			<td colspan="2">https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex Ultimate 3000, XRS pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex AXP-MS auxiliary pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Software, Software Tools, Database search</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Kfits: Fit aggregation Data</td>
			<td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermo Scientific Xcalibur software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td>
			<td style="width:256px;">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Chronos software (Axel Semrau)</td>
			<td style="width:256px;">http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteome Discoverer V1.4 software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HDX workbench software</td>
			<td colspan="3">http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

Levende organismen moeten regelmatig omgaan met wisselende omgevingen tijdens hun levenscyclus, met inbegrip van veranderingen in de temperatuur, pH, de accumulatie van reactieve zuurstof soorten en meer. Deze schommelingen kunnen leiden tot een wijdverbreid eiwit ontplooiing, aggregatie, en cel dood. Cellen zijn dus een dynamische en stress-specifieke netwerk van moleculaire chaperones, die een "gezond" Proteoom tijdens stress voorwaarden handhaven geëvolueerd. ATP-onafhankelijke chaperones vormen een belangrijke klasse van moleculaire chaperones, die als moleculen van de eerstelijns defensie, bescherming tegen aggregatie van eiwitten in een stress-afhankelijke manier dienen. Een functie die deze chaperones gemeen hebben is hun vermogen om structurele plasticiteit voor hun stress-specifieke activatie, de erkenning, en de versie van de misfolded-client gebruiken.
In dit artikel focussen we op de functionele en structurele analyse van een dergelijke intrinsiek ongeordende chaperon, de bacteriële redox-gereglementeerde Hsp33, die tegen aggregatie tijdens oxidatieve stress eiwitten beschermt. Hier presenteren wij een toolbox van diverse technieken voor de studie van de Chaperon redox-gereglementeerde activiteit, evenals voor het toewijzen van conformationele wijzigingen van de Chaperon, ten grondslag liggen aan de activiteit. Specifiek, beschrijven we een werkstroom waarin de voorbereiding van volledig verminderde en volledig Geoxideerde proteïnen, gevolgd door een analyse van de Chaperon anti-aggregatie-activiteit in vitro met behulp van licht-verstrooiing, gericht op de mate van de anti-aggregatie activiteit en haar kinetiek. Om te overwinnen frequente uitschieters verzameld gedurende aggregatie testen, beschrijven we het gebruik van Kfits, een nieuwe grafische tool waarmee gemakkelijk verwerking van kinetische metingen. Dit hulpmiddel kan gemakkelijk worden toegepast op andere soorten kinetische metingen voor het verwijderen van uitschieters en passend kinetische parameters. Om de functie correleren met de eiwitstructuur, beschrijven we de installatie en de workflow van een structurele massaspectrometrie techniek, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie, waarmee de toewijzing van conformationele wijzigingen op de Chaperon en substraat tijdens verschillende stadia van de activiteit van de Hsp33. Dezelfde methode kan worden toegepast op andere eiwit-eiwit en eiwit-ligand interacties.

De twee methoden gepresenteerd maken het mogelijk de kinetische activiteit en de dynamiek van eiwit interacties tussen een chaperone en zijn substraat te volgen. Bovendien is de reductie-oxidatie-protocol kunnen de voorbereiding van een volledig verminderde en volledig geoxideerd chaperon, geven een meer diepgaand inzicht in het mechanisme van de activering van redox-afhankelijke ongeordende chaperones.
Ten eerste hebben we gebr...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

Een van de meest uitdagende stress voorwaarden die organismen tijdens hun leven tegenkomen gaat de accumulatie van oxidanten. Tijdens oxidatieve stress afhankelijk cellen sterk zijn van moleculaire chaperones. Hier presenteren we methoden voor het onderzoeken van de redox-gereglementeerde anti-aggregatie activiteit, evenals het monitoren van de structurele veranderingen in het bestuur van de Chaperon-functie met behulp van HDX-MS.

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Een plasmamonstervoorbereiding voor massaspectrometrie met behulp van een geautomatiseerd werkstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...