Name: defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

המחברים הם אסיר תודה מיטל להריץ מתקפה לדיונים מועיל שלה קריטי הקריאה של המאמר, ואת פטריק גריפין, חברי המעבדה שלו לסיוע שלהם ללא הגבלה בזמן הקמת פלטפורמה ניתוח HDX. המחברים מודים על קרן גרמניה-ישראל (I-2332-1149.9 2012), הקרן הדו-לאומית למדע (2015056), מארי קירי אינטגרציה המענק (618806), הקרן הלאומית למדע (1765/13 ו- 2629/16), ואת המדע הגבול האנושי תוכנית (CDA00064/2014) לתמיכה הפיננסית שלהם.

1. הכנת חלבונים מופחת באופן מלא, מלא מחומצנת
<ol><li>
הכנה של חלבון מלא מופחת הערה: כאן, אנו מתארים ההפחתה של חלבונים המכילים אבץ ושימוש ZnCl2 פתרון כדי לשחזר את המצב חלבון Zn-שילב, מופחתת. הפתרון2 ZnCl ניתן להחליפם או שנמחקו. שימו לב כי הזמן ואת הטמפרטורה של תהליך הפחתת תלוי חלב...

בנייר זה, סיפקנו פרוטוקולים עבור הניתוח של פעילות המלווה תלוי-חמצון-חיזור, אפיון שינויים מבניים על הכריכה של חלבון הלקוח. אלה משלימים מתודולוגיות להגדיר מתחמי המלווה-המצע פוטנציאליים ולנתח אתרים אינטראקציה פוטנציאלית.
כאן, אנחנו מוחלים פרוטוקולים אלה עבור אפיון קומפלקס ב?...

תאים פוגש לעתים קרובות הצטברות של מינים חמצן תגובתי (ROS) הפיק כמו תוצרי לוואי של נשימה1,2, חלבון, שומנים בדם-חמצון-3,-4תהליכים נוספים5, 6,7. למרות תפקיד של ROS מועיל בתהליכים ביולוגיים מגוונים כגון הסלולר איתות8,9 , התגובה החיסונית10, חוסר איזון בין ROS הייצור שלה ניקוי רעלים עשויה להתרחש, המוביל חמצוני להדגיש7. המטרות הביולוגי של ROS הם חלבונים, ליפידים, חומצות גרעין, החמצון של אשר משפיעים על מבנה ותפקוד שלהם. לכן, ההצטברות של הסלולר חמצון חזק מקושר במגוון רחב של פתולוגיות כולל סרטן9,11,12,דלקת13הזדקנות14, 15, נמצאו מעורבים תחילת התפתחות הפרעות ניווניות כגון אלצהיימר, פרקינסון של ואת ALS מחלת16,17,18.
חלבונים הן מסונתז לאחרונה, בוגרת רגישים מאוד חמצון לאור כל השינויים מזיקות של השרשראות בצד שלהם, המעצבים חלבון מבנה ותפקוד19,20. לכן, סטרס חמצוני בדרך כלל מוביל חלבון נפוץ איון, misfolding, מצבור, המוביל בסופו של דבר למוות של התא. אחת האסטרטגיות הסלולר אלגנטית להתמודד עם הנזק הפוטנציאלי של חלבון חמצון זה לנצל את מלווים תלויי-חמצון-חיזור, אשר מעכבים את המצבור חלבון נרחבת, במקום יצירת קומפלקסים יציבים עם חלבונים misfolded לקוח21 22, ,23. אלה מלווים שורה ראשונה הגנה מופעלים במהירות על ידי חמצון בייעודי לאתר (בדרך כלל על שאריות ציסטאין) הממיר אותן מולקולות אנטי-צבירת עוצמה24. מאז סטרס חמצוני תוצאות עיכוב של נשימה, ירידה רמות ATP הסלולר25, מלווים תלויית ATP הקנוני הם פחות יעילים בזמן סטרס חמצוני תנאים25,26 ,27. לכן, חמצון-חיזור מופעל מלווים תלויית ATP ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס חלבון על ההצטברות של חמצון ב חיידקים וב פרוקריוטים (למשל, Hsp3328 , רידא29 ב חיידקים, Get330 , שמרים, peroxiredoxins31 פרוקריוטים). הפעילות של אלה מלווים בחום תלוי הפיך הסתגלותי שינויים מבניים הנגרמת על ידי חמצון בייעודי לאתר זה חושף מעורב ההכרה של חלבונים misfolded לקוח הידרופובי אזורים.
מחקר של מנגנון אנטי-צבירת ועקרונות המסדירים את ההכרה של החלבונים הלקוח על ידי מלווים אינה קלה בשל אופיו נדלנית ודינמיקה של המלווה-המצע אינטראקציות32,33, 34,35,36,37. עם זאת, מלווים מוסדר מתח יש הזדמנות לקדם את ההבנה שלנו של פונקציית צבירה אנטי בשל היכולת שלהם: 1) לקבל שתי צורות שונות של המלווה, פעיל (למשל, מחומצן) לא פעיל (למשל, מופחת), עם הקדמה או הסרה של תנאי הלחץ בקלות להחליף ביניהם (למשל, חמצון, צמצום הסוכן), 2), יש מגוון רחב של מצעים, 3) קומפלקסים יציבים מאוד עם החלבונים לקוח זה יכול להיות מוערך על ידי מתודולוגיות מבניים שונים, ו- 4) להתמקד אך ורק על המצע זיהוי ושחרור, מתווכת על-ידי שינויים הסתגלותי תלויי-חמצון-חיזור, כמו הרוב המכריע של אלה מלווים חסר יכולת קיפול.
כאן, אנחנו מנתחים פעילות אנטי-צבירת חיידקי מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33, מרכיב חיוני של מערכת הביטחון חיידקי נגד חמצון-induced חלבון צבירת28. כאשר מופחתת, Hsp33 הוא חלבון מחייב אבץ בחוזקה מקופל עם שום פעילות המלווה; עם זאת, כאשר הם נחשפים סטרס חמצוני, Hsp33 עובר שינויים נרחבים הסתגלותי החושפות את המצע איגוד אזורים38,39. על חמצון, יון אבץ המאוגד חריפה ארבע ציסטאין שנשמרת מאוד שאריות של התחום C-מסוף הוא שוחרר40. התוצאה על היווצרות שני דיסולפידי חוב, התגלגלות של התחום C-מסוף, לבין הקשורה של אזור מקשר סמוכים41. האזורים C-מסוף, מקשר גמיש במיוחד, מוגדרים כמו מהותית או חלקית סמוקים. עם שובו לתנאים שאינם מתח, cysteines מצטמצמות ומחזירה המלווה למצבו מקופל מקורית עם שום פעילות אנטי-צבירה. Refolding של המלווה מוביל ייפתחו עוד יותר, destabilization של החלבון לקוח מאוגד, אשר מפעיל את ההעברה למערכת המלווה הקנוני, DnaK/J, עבור refolding38. ניתוח האתרים האינטראקציה של Hsp33 מרמז כי Hsp33 משתמשת בשני שלה טעונה סמוקים אזורים, כמו גם את האזורים הידרופובי מקשר, תחום N-מסוף כדי ללכוד misfolded חלבונים הלקוח ולמנוע צבירת שלהם38, 42. במצב מקופל, אזורים אלה מוסתרים על ידי מקופלת מקשר C-מסוף תחום. מעניין, האזור מקשר משמש שוער של מצב מקופל ובלתי פעילה של Hsp33, "חש" מעמד מתקפל שלה מחשבים סמוכים C-מסוף34. ברגע גרם אולי לפגיעה ביציבות על ידי מוטגנזה מכוונת (גם על ידי מוטציה או של ההפרעות רצף מלא), Hsp33 מומר מלווה צורונים פעילים בכל מקרה מצב חמצון-חיזור שלה רגיש חמצון-חיזור cysteines43.
הפרוטוקולים המובאת כאן מאפשרים ניטור של Hsp33 פעילות המלווה תלוי-חמצון-חיזור, כמו גם שינויים הסתגלותי מיפוי על הפעלת ואיגוד של הלקוח חלבונים. מתודולוגיה זו ניתן להתאים מחקר מלווה-לקוח זיהוי דגמים אחרים, כמו גם אינטראקציות חלבון שאינו מלווה. יתר על כן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור הכנת מלווים מלא מופחת, מחמצנים יכולים לשמש במחקרים אחרים חלבונים חמצון-חיזור-switch, כדי לחשוף את תפקידי פוטנציאלי של חלבון חמצון על פעילות החלבון.
באופן ספציפי, אנו מתארים הליך לפקח המלווה הפעילות במבחנה ולהגדיר שלה ירידה לפרטים המצע תחת סוגים שונים של צבירת חלבון (כימי או תרמית המושרה) באמצעות פיזור אור (LS) נמדדת fluorospectrometer44. במהלך מצבור, אור פיזור ב 360 nm מגדיל במהירות עקב עכירות הגוברת. לפיכך, צבירת ניתן לנטר באופן תלוי-זמן ובאורך הגל הזה. ? האם היא שיטה מהירה ורגיש לבדיקת חלבון צבירת ובכך הפעילות האנטי-צבירה של חלבון עניין באמצעות ריכוז nanomolar, המאפשרת אפיון חלבון צבירת קינטי פרמטרים הקשורים תחת שונות תנאים. יתר על כן, הפרוטוקול LS המתוארים כאן אינו דורש מכשור יקר, ניתן ליצור בקלות במעבדה כלשהי.
עם זאת, די מאתגר כדי להשיג. את עקומות קינטי "נקי" וכדי שואבים פרמטרים קינטי של חלבון אור כזה פיזור ניסויים, בשל רעש ואת המספר הגדול של ליניאריים שנוצרו על-ידי בועות אוויר, אגרגטים גדולים. כדי להתגבר על מכשול זה, אנו מציגים את הרומן כלי גרפי, Kfits45, להשתמש להפחתת רמת הרעש במדידות קינטית שונה, מותאם במיוחד עבור חלבון צבירת נתונים קינטי. תוכנה זו מספקת ראשונית פרמטרים קינטי הערכה מוקדמת של התוצאות ומאפשרת למשתמש "נקי" כמויות גדולות של נתונים במהירות מבלי להשפיע על תכונותיו קינטי. Kfits הוא מיושם פייתון וזמין קוד פתוח בגיל 45.
אחת השאלות מאתגרת בתחום מתייחס מיפוי אתרי האינטראקציה בין מלווים וחלבונים לקוח שלהם ולהבין איך מלווים לזהות מגוון רחב של סובסטרטים misfolded. שאלה זו היא יותר מסובך כאשר לומד קומפלקסים דינמי מאוד חלבון אשר כרוכים ממהותם סמוקים מלווים ותערובות צבירת מועדת. למרבה המזל, ספקטרומטר מסה מבניים התקדמה באופן דרמטי במהלך העשור האחרון, סיפק בהצלחה מועיל גישות וכלים כדי לנתח את פלסטיות מבניים מפת משקעים מעורב חלבון זיהוי46, 47 , 48 , 49. כאן, אנו מציגים אחד כזה טכניקה-מימן-דאוטריום exchange ספקטרומטר מסה (HDX-MS)-מה שמאפשר את המיפוי של שינויים ברמת שאריות קונפורמציה מבנית שינוי חלבון או חלבון/ליגנד מחייב35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS משתמשת ההחלפה רציף של עמוד השדרה hydrogens על ידי דאוטריום, הקצב של אשר מושפעת הסביבה כימי, נגישות, ואת קוולנטיות על קשרים הדדיים56. HDX-MS עוקב אחר תהליכים אלה exchange באמצעות בתור ממיס deuterated, בדרך כלל מים כבדים (D2O), ומאפשר מדידה המבוססת על שינוי משקל מולקולרי בעקבות המימן דאוטריום exchange. איטי שערי החליפין מימן-דאוטריום עלולה לגרום hydrogens השתתפות קשרי מימן, או, בפשטות, מעצורים הסטריים, אשר מציינת שינויים המקומיות מבנה57. שינויים על איגוד ליגנד או שינויים post-translational יכול גם להוביל הבדלים הסביבה מימן, עם איגוד וכתוצאה מכך הבדלים מימן-דאוטריום exchange (HDX) המחירים46,53.
אנחנו להחיל טכנולוגיה זו לאזורים 1) מפה Hsp33 אשר במהירות נפרשים על חמצון, שמוביל ההפעלה של Hsp33, ו- 2) הגדרת ממשק איגוד פוטנציאלי של Hsp33 עם סובסטרט misfolded באורך מלא שלו, ציטרט סינתאז (CS)38.
ניתן להחיל בשיטות המתוארות בכתב יד זה ללמוד בחריגי חמצון-חיזור של חלבונים במבחנה, צבירת נגד פעילות ואת התפקיד של שינויים מבניים (אם בכלל) בתפקוד החלבון. מתודולוגיות אלה יכול להיות בקלות להתאים מגוון מערכות ביולוגיות ומוחלים במעבדה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1588px;" width="1588">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Chemicals, Reagents</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Acetonitrile HPLC plus</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34998-2.5L</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Methanol</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">76-05-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Water for HPLC</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnCl2, Zinc Chloride</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B0755416 308</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT</td>
			<td>goldbio</td>
			<td>27565-41-9</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PD mini trap G-25 columns GE healthcare</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-9180-07</td>
			<td>desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Phosphate</td>
			<td>United states Biochemical Corporation</td>
			<td>20274</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K46809910526</td>
			<td>oxidizing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">citrate synthase</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3260</td>
			<td>substrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES acid free</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7365-45-9</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gndcl</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3272-500G</td>
			<td>denaturant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Chloride Solution</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">543047-10G</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Oxide 99%</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">151882-100G</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td style="width:256px;">bioworld</td>
			<td style="width:119px;">42000058-2</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">150uL Micro-Insert with Mandrel Interior &#38; Polymer Feet, 29*5mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quartz cuvette</td>
			<td style="width:256px;">Hellma 101-QS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Instruments</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Jasco FP-8500 Fluorospectrometer</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:256px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13058/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">pH meter , PB-11 sartorius</td>
			<td style="width:256px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">13119/0</td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).</td>
			<td style="width:256px;">AffiPro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td>
			<td style="width:256px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door</td>
			<td style="width:256px;">COY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Q-exactive-orbitrap mass spectrometer</td>
			<td style="width:256px;">Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples</td>
			<td style="width:256px;">PAL system</td>
			<td colspan="2">https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex Ultimate 3000, XRS pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex AXP-MS auxiliary pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Software, Software Tools, Database search</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Kfits: Fit aggregation Data</td>
			<td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermo Scientific Xcalibur software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td>
			<td style="width:256px;">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Chronos software (Axel Semrau)</td>
			<td style="width:256px;">http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteome Discoverer V1.4 software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HDX workbench software</td>
			<td colspan="3">http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

אורגניזמים חיים באופן קבוע צריך להתמודד עם סביבות המשתנות במהלך מחזור החיים שלהם, לרבות שינויי טמפרטורה, pH, ההצטברות של מינים חמצן תגובתי, ועוד. תנודות אלו יכולים להוביל חלבון נפוץ התגלגלות, מצבור, והתא מוות. לכן, התאים התפתחו רשת דינמיים, הלחץ ספציפיות של מלווים מולקולרית, המקיימות פרוטאום "בריא" במהלך מתח תנאים. מלווים תלויית ATP מהווים שיעור מרכזי אחד של משגיחים מולקולרית, אשר לשמש מולקולות שורה ראשונה הגנה, הגנה מפני צבירת חלבון באופן תלויי-מתח. תכונה אחת שאלה מלווים שמשותף הוא היכולת לנצל פלסטיות מבניים שלהם ההפעלה הספציפי מתח, זיהוי של שחרור של הלקוח misfolded.
בנייר זה, אנו מתמקדים ניתוח פונקציונלי ומבניים של אחד כזה מהותי המתוסבכים, המלווה חיידקי מוסדר חמצון-חיזור Hsp33, אשר מגן על חלבונים נגד צבירת במהלך סטרס חמצוני. כאן, אנו מציגים ארגז של טכניקות מגוונות ללמוד פעילות המלווה מוסדר חמצון-חיזור, כמו גם עבור מיפוי הסתגלותי שינויים של המלווה, בבסיס פעילותה. באופן ספציפי, אנו מתארים זרימת עבודה הכולל הכנת חלבונים מופחת באופן מלא, מלא מחמצנים, ואחריו ניתוח של ה מלווה פעילות אנטי-צבירת במבחנה באמצעות פיזור אור, התמקדות מידת פעילות אנטי-צבירת וקינטיקה שלה. כדי להתגבר על ליניאריים תכופים שנצבר במהלך מבחני צבירה, נתאר את השימוש Kfits, כלי גרפי חדשנית המאפשרת עיבוד קל של מדידות קינטי. בכלי זה ניתן להחיל בקלות סוגים אחרים של מדידות קינטי עבור הסרת ליניאריים התאמת הפרמטרים קינטי. כדי לתאם את הפונקציה עם מבנה החלבון, נתאר את ההתקנה של זרימת העבודה של טכניקה ספקטרומטר מסה מבניים, מימן-דאוטריום exchange ספקטרומטר מסה, המאפשר את המיפוי של שינויים הסתגלותי על המלווה, המצע בשלבים שונים של פעילות Hsp33. המתודולוגיה אותן ניתן ליישם אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-ליגנד אחרים.

שתי השיטות הציג מאפשרים לעקוב אחר פעילות קינטי של הדינמיקה של חלבון אינטראקציות בין מלווה את המצע שלה. יתר על כן, הפרוטוקול הפחתת-חמצון מאפשר הכנת מלווה מופחת באופן מלא, מלא מחמצנים, נותן הבנה מעמיקה יותר של מנגנון ההפעלה של משגיחים המתוסבכים תלויי-חמצון-חיזור.
<p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

אחד התנאים המאתגרים ביותר מתח כי אורגניזמים נתקלים במהלך חייהם כרוכה ההצטברות של חמצון. במהלך סטרס חמצוני, תאים בכבדות להסתמך על מלווים מולקולרית. כאן, אנו מציגים שיטות השתמשו כדי לחקור את מוסדר חמצון-חיזור צבירת נגד הפעילות, כמו גם כדי לעקוב אחר שינויים מבניים המסדירים את הפונקציה המלווה באמצעות HDX-MS.

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...