Name: defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

저자는 그녀의 도움이 토론에 대 한 Meytal Radzinski에 게 감사 하 고 HDX 분석 플랫폼을 설정 하는 동안 그들의 무제한 지원에 대 한 문서, 그리고 패트릭 그리핀와 그의 실험실 멤버를 읽고 중요 한 있습니다. 저자는 독일-이스라엘 재단 (나-2332-1149.9/2012), Binational 과학 재단 (2015056), 마리 퀴리 통합 그랜트 (618806), 이스라엘 과학 재단 감사 (1765/13 고 2629/16), 그리고 인간 프론티어 과학 그들의 재정 지원 프로그램 (CDA00064/2014).

1. 완벽 하 게 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비
<ol><li>
완벽 하 게 감소 된 단백질의 준비 참고: 여기, 우리가 설명 아연 포함 된 단백질 및 단백질 Zn 통합, 감소 된 상태를 복원할 ZnCl2 를 사용 하 여 솔루션의 감소. ZnCl2 솔루션 대체 하거나 삭제 될 수 있습니다. Note 시간과 온도 감소 과정의 단백질 안정성과 기능에 따라 달라 집니다 및 특정 단백질 당 이렇...

이 문서에서 우리는 redox 종속 보호자 활동의 분석 및 클라이언트 단백질의 바인딩 따라 구조 변화의 특성에 대 한 프로토콜 제공. 이들은 잠재적인 보호자 기판 단지 정의 하 고 잠재적인 상호 작용 사이트 분석을 보완 방법론입니다.
여기, 우리는 잘 공부 보호자 기판 CS와 redox 규제 보호자 Hsp33 사이 복잡 한 특성에 대 한 이러한 프로토콜을 적용. 우리는 두 가지 유형의 단백?...

셀 자주 발생 하는 반응성 산소 종 (선생님)의 호흡1,2, 단백질 및 지질 산화3,4및 추가 프로세스5, 부산물 생산의 축적 6,7. 선생님 셀룰러 신호8,9 및 면역 응답10등 다양 한 생물학 과정에서 유익한 역할에 불구 하 고 선생님 생산 및 그것의 해독 사이의 불균형이 발생할 수 있습니다, 산화를 선도 7스트레스. 선생님의 생물 목표 단백질, 지질 및 핵 산의 산화가 그들의 구조와 기능에 영향을 미칠 있습니다. 따라서, 셀룰러 oxidants의 축적은 강하게 pathologies 암9,11, 염증12,13, 노화14, 등의 다양 한 범위에 연결 15, 그리고 발병 및 Alzheimer의, 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환의 진행, 그리고 루 게 릭 병 질환16,,1718에 관련 된 발견 되었습니다.
모두 새로 합성 하 고 성숙한 단백질 단백질 구조와 기능19,20모양 그들의 사이드 체인의 잠재적으로 유해한 수정으로 인 산화에 매우 민감합니다. 따라서, 산화 스트레스는 일반적으로 광범위 한 단백질 비활성화, misfolding 및 집계, 결국 세포 죽음으로 이어지는 리드. 광범위 한 단백질 집계 misfolded 클라이언트 단백질21와 안정 되어 있는 복합물을 형성 하는 대신 억제 redox 종속 보호자를 활용 하는 단백질 산화의 잠재적인 손상에 대처 하기 위해 우아한 셀룰러 전략 중 하나 ,,2223. 이 첫 번째-라인 방어 보호자 강력한 안티 집계 분자24로 그들을 변환 하는 (보통에 시스테인 잔류물) 사이트별 산화에 의해 급속 하 게 활성화 됩니다. 산화 스트레스 조건25,26 동안 정식 ATP 의존 보호자는 덜 효과적인 산화 스트레스 결과 호흡 억제 및 세포질 ATP 레벨25감소, 이후 27. 따라서, ATP 독립 보호자 redox 활성화 재생 oxidants 박테리아 및 진핵생물의 축적에 따라 단백질 항상성 유지에 중요 한 역할 (예:Hsp3328 , RidA29 박테리아, Get3에에서30 효 모, peroxiredoxins31 진핵생물에서에서). 이러한 보호자의 활동 강하게 소수 지역 misfolded 클라이언트 단백질의 인식에 관련 된 폭로 사이트 산화에 의해 유도 된 가역 구조 구조적 변화에 따라 달라 집니다.
반대로 집계 메커니즘 및 클라이언트 단백질의 인식 보호자에 의해 통치 원리의 연구 보호자 기판 상호 작용32,33의 역동적이 고 heterogenic 특성상 쉽지 않다 34,35,,3637. 그러나, 스트레스 통제 보호자는 그들의 능력 때문 반대로 집계 함수에 대 한 우리의 이해를 전진 하는 기회: 1)는 보호자, (예를 들면, 산화) 활성 및 비활성 (예를 들어, 두 가지 형태를 얻을 감소), 소개 또는 쉽게 전환 (예:산화 제, 환 원제), 그들 2 스트레스 조건 제거)는 광범위 한 기판, 3) 클라이언트 단백질에 의해 평가 될 수 있는 매우 안정적인 단지 형성 다른 구조적 방법론, 및 4) 기판 인식 및 릴리스, 대부분 이러한 보호자의 접는 기능 부족으로 redox-종속 구조적 변화에 의해 중재에 전적으로 초점을.
여기, 우리 세균 redox 규제 보호자 Hsp33의 안티 집계 활동, 산화 유도 단백질 집계28에 대 한 세균 방어 시스템의 중요 한 구성 요소를 분석합니다. Hsp33는 활동 없이 보호자; 밀접 하 게 접힌된 아연-바인딩 단백질 감소, 그러나, 산화 스트레스에 노출 되 면 Hsp33의 기판 바인딩 지역38,39노출 광범위 한 구조적 변화를 겪 습. 산화, 시 C 터미널 도메인의 4 개의 높은 보존된 시스테인 잔류물에 강력 하 게 바인딩된 아연 이온 출시40입니다. 이 결과 C 터미널 도메인 및 인접 한 링커 지역41의 불안의 전개는 두 개의 이황화 결합의 대형에. C-터미널, 링커가 지역은 매우 유연 하며 본질적으로 또는 부분적으로 무질서로 정의 됩니다. 아닌 스트레스 조건에 반환, 시는 시스테인 감소 되 고는 보호자 안티 집계 활동 없이 네이티브 접힌된 상태로 돌아갑니다. 보호자의 refolding 더 전개를 지도 하 고 바인딩된 클라이언트 단백질 트리거 refolding38정식 보호자 시스템, DnaK/J, 그것의 이동의 불안정. Hsp33의 상호 작용 사이트의 분석 제안 Hsp33 사용 하 여 두의 충전 무질서 잡으려고 링커 N 맨끝 도메인에 소수 성 영역 뿐만 아니라 영역 클라이언트 단백질을 misfolded 고 방지 그들의 집계38, 42. 접힌된 상태에서이 지역 접힌된 링커 및 C 터미널 도메인으로 숨겨져 있습니다. 흥미롭게도, 링커 지역 "감지" 그것의 인접 한 C 터미널 도메인34의 접는 상태 Hsp33의 접힌된 비활성 상태의 게이트 키퍼 역할을 합니다. (포인트 돌연변이 또는 전체 순서 섭 동에 의해 중) mutagenesis에 의해 불안정 하 게, 일단 그것의 산화 환 원에 민감한 시스테인43의 산화 환 원 상태 Hsp33 constitutively 활성 보호자 관계 없이로 변환 됩니다.
여기에 제시 된 프로토콜 활성화 시 매핑은 구조적 변화 뿐만 아니라 Hsp33의 redox 종속 보호자 활동 모니터링 클라이언트 단백질의 바인딩을 허용 합니다. 이 방법론은 다른 보호자 클라이언트 인식 모델 뿐만 아니라 비 보호자 단백질-단백질 상호 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 단백질 활동에 단백질 산화의 잠재적인 역할을 다른 산화 환 원 스위치 단백질의 연구에 사용할 수 있는 완벽 하 게 감소 하 고 산화 보호자의 준비에 대 한 프로토콜을 제시.
우리가 보호자 활동에서 생체 외에서 모니터링 하 고 다른 유형의 단백질 집계 (화학적 또는 열 유도) 산란 (LS)에 의해 측정을 사용 하 여에서 그것의 기질 특이성을 정의 하는 절차를 설명 하는 구체적으로 fluorospectrometer44. 집계, 동안 360 nm 증가 급속 하 게 증가 탁 때문에 분산을 빛. 따라서,이 파장에서 시간에 따른 방식으로 집계를 모니터링할 수 있습니다. LS는 단백질 집계 및 따라서 nanomolar 농도, 활성화 단백질 집계 관련 운동 매개 변수에서 다른 특성을 사용 하 여 관심사의 단백질의 안티 집계 작업 테스트를 위한 신속 하 고 민감한 방법 조건입니다. 또한, 여기에 설명 된 LS 프로토콜 비싼 장비를 요구 하지 않는다 그리고 어떤 실험실에 쉽게 설치 될 수 있다.
그럼에도 불구 하 고, 그것은 "깨끗 한" 운동 곡선을 얻을 수와 같은 빛을 뿌리는 실험, 소음 및 공기 방울 및 큰 집계에 의해 생성 된 outliers의 많은 수에서 단백질의 운동 매개 변수를 파생 하는 매우 도전. 이 장애물을 극복 하기 위해 소설 그래픽 도구, Kfits45, 다른 운동 측정, 특히 단백질 집계 운동 데이터에 대 한 장착에 잡음 레벨을 감소 시키기를 위해 사용 하는 것이 선물이. 이 소프트웨어는 결과의 초기 평가 대 한 예비 운동 매개 변수를 제공 하 고 "깨끗 한" 많은 양의 데이터 신속 하 게 운동 속성을 영향을 주지 않고 사용자 수 있습니다. Kfits 파이썬에서 구현 이며 45오픈 소스에서 사용할 수 있습니다.
필드에 도전적인 질문 중 하나는 보호자와 그들의 클라이언트 단백질 사이 상호 작용 사이트를 매핑 및 보호자 misfolded 기판의 넓은 범위를 인식 하는 방법을 이해 관련이 있습니다. 이 질문은 더 복잡 보호자 및 집계 경향이 기판 무질서 공부 본질적으로 포함 하는 매우 동적인 단백질 복합물. 다행히도, 구조 질량 분석은 극적으로 지난 10 년간 고급 고가 성공적으로 도움이 접근 및 구조상가 소성을 분석 하 고 잔류물 단백질 인식46, 에 지도 하는 도구 47 , 48 , 49. 여기, 선물이 하나 이러한 기술은 수소 중수소 교환 질량 분석 (HDX-MS)-단백질 수정 또는 단백질/Ligand 바인딩35, 구조 형태에 잔류물 수준 변경의 매핑 수 있습니다 50,51,,5253,54,55. HDX MS 중수소, 화학 환경, 접근성, 속도의 영향을 받는 여 백본 hydrogens의 지속적인 교류를 사용 및 공유 및 공유 결합56. HDX MS deuterated 용 매, 일반적으로 중 수 (D2O)를 사용 하 여 이러한 exchange 프로세스를 추적 하 고 측정 수소 중수소 교환에 따라 분자량의 변화에 따라 수 있습니다. 수소 중수소 교환 속도가 느리거나 hydrogens 수소 결합에 참여 또는, 간단 하 게, 구조57에서 로컬 변경 사항을 나타내는 입체 방해에서에서 발생할 수 있습니다. Ligand 바인딩 또는 포스트 번역 상 수정 변경 수소 중수소 교환 (HDX) 요금46,53에 차이에 결과 바인딩을 사용 하 여 수소 환경에 차이 또한 발생할 수 있습니다.
우리는 급속 하 게 산화, Hsp33의 활성화로 이어지는 시 전개 2) 그것의 전체 길이 misfolded 기판, 구 연산 염 synthase (CS)38와 Hsp33의 잠재적인 바인딩 인터페이스 정의 1) 지도 Hsp33 지역에이 기술을 적용.
이 원고에 설명 된 방법은 redox 종속 기능 단백질에 체 외에, 안티 집계 활동 및 정의 구조 변경의 역할 (있을 경우) 단백질 기능 연구에 적용할 수 있습니다. 이러한 방법론을 쉽게 다양 한 생물 학적 시스템에 적응 하 고 실험실에서 적용 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1588px;" width="1588">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Chemicals, Reagents</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Acetonitrile HPLC plus</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34998-2.5L</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Methanol</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">76-05-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Water for HPLC</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnCl2, Zinc Chloride</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B0755416 308</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT</td>
			<td>goldbio</td>
			<td>27565-41-9</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PD mini trap G-25 columns GE healthcare</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-9180-07</td>
			<td>desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Phosphate</td>
			<td>United states Biochemical Corporation</td>
			<td>20274</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K46809910526</td>
			<td>oxidizing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">citrate synthase</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3260</td>
			<td>substrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES acid free</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7365-45-9</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gndcl</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3272-500G</td>
			<td>denaturant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Chloride Solution</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">543047-10G</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Oxide 99%</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">151882-100G</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td style="width:256px;">bioworld</td>
			<td style="width:119px;">42000058-2</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">150uL Micro-Insert with Mandrel Interior &#38; Polymer Feet, 29*5mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quartz cuvette</td>
			<td style="width:256px;">Hellma 101-QS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Instruments</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Jasco FP-8500 Fluorospectrometer</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:256px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13058/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">pH meter , PB-11 sartorius</td>
			<td style="width:256px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">13119/0</td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).</td>
			<td style="width:256px;">AffiPro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td>
			<td style="width:256px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door</td>
			<td style="width:256px;">COY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Q-exactive-orbitrap mass spectrometer</td>
			<td style="width:256px;">Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples</td>
			<td style="width:256px;">PAL system</td>
			<td colspan="2">https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex Ultimate 3000, XRS pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex AXP-MS auxiliary pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Software, Software Tools, Database search</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Kfits: Fit aggregation Data</td>
			<td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermo Scientific Xcalibur software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td>
			<td style="width:256px;">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Chronos software (Axel Semrau)</td>
			<td style="width:256px;">http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteome Discoverer V1.4 software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HDX workbench software</td>
			<td colspan="3">http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

생명체는 온도, pH, 반응 산소 종의 축적 등에서 변화를 포함 하 여 그들의 수명 주기 동안 환경 변동에 대처 하기 위해 정기적으로 필요 합니다. 이러한 변동 광범위 한 단백질 전개, 집계,으로 이어질 수 있으며 세포 죽음. 따라서, 세포 스트레스 조건 중 "건강 한" 프로테옴을 유지 하는 분자 보호자의 역동적이 고 스트레스 관련 네트워크를 진화 했다. ATP-독립 보호자 일선 방위 분자, 스트레스-종속 방식에서 단백질 집계에 대 한 보호로 봉사 하는 분자 보호자의 1 개의 주요 클래스를 구성 합니다. 한 이러한 보호자 공통점 기능은 그들의 스트레스 관련 활성화, 인식 및 misfolded 클라이언트의 버전에 대 한 구조적인가 소성을 활용 하는 능력.
이 문서에서 우리는 한 그러한 본질적으로 무질서 보호자, 단백질 산화 스트레스 동안 집계에 대 한 보호는 세균성 산화 규제 Hsp33의 기능 및 구조 분석에 집중 한다. 여기, 선물이, 보호자의 구조적 변화를 매핑 뿐만 아니라 보호자 redox 규제 활동, 공부에 대 한 다양 한 기술의 도구 상자 밑에 그것의 활동. 특히, 우리는 보호자 안티 집계 활동에서 생체 외에서 빛 산란을 사용 하 여의 정도에 초점을 맞추고의 분석 이어서 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비를 포함 하는 워크플로 설명 합니다 반대로 집계 활동과 그 활동입니다. 극복 하기 위해 자주 outliers 집계 분석 하는 동안 축적 된, Kfits, 운동 측정의 쉬운 처리를 수 있는 새로운 그래픽 도구 사용을 설명 합니다. 이 도구는 쉽게 다른 유형의 outliers를 제거 및 운동 매개 변수 피팅 운동 측정에 적용할 수 있습니다. 단백질 구조와 기능을 연결할 설치 및 워크플로 구조 질량 분석 기술, 수소 중수소 교환 질량 분석, 구조적 변화의 매핑은 보호자 수의 설명 및 Hsp33 활동의 다른 단계 동안 있는 기질 다른 단백질-리간드 및 단백질-단백질 상호 작용에는 동일한 방법론을 적용할 수 있습니다.

제시 하는 두 가지 방법 운동 활동과 보호자와의 기판 간의 단백질 상호 작용의 역동성에 따라 가능 하 게. 또한, 감소-산화 프로토콜 redox 의존 무질서 보호자의 활성화 메커니즘의 더 심도 있는 이해를 주는 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 보호자의 준비를 수 있습니다.
첫째, 우리는 보호자의 redox 종속 활동 검사 산란 사?...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

연구

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...