Name: defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Forfatterne er takknemlig å Meytal Radzinski for hennes nyttig diskusjoner og kritisk lesing av artikkelen og Patrick Griffin og hans lab medlemmer for deres ubegrenset hjelp ved opprettelse HDX analyse plattform. Forfatterne er takknemlig for den tysk-Israel Foundation (I-2332-1149.9/2012), den Binational Science Foundation (2015056), Marie Curie integrering tilskudd (618806), Israel Science Foundation (1765/13 og 2629/16), og den menneskelige Frontier vitenskap Programmet (CDA00064/2014) for deres støtte.

1. forberedelse av fullt redusert og fullstendig oksidert proteiner
<ol><li>
Utarbeidelse av en fullt redusert protein Merk: Her beskriver vi reduksjon av sink inneholder protein og bruke en ZnCl2 løsning gjenopprettet Zn-innlemmet, redusert protein. ZnCl2 løsningen kan være erstattet eller forkastet. Merk at tid og temperatur av reduksjon avhenger av protein stabilitet og funksjon, og er dermed bestemte per protein.<ol>
<li>Tine protein prøven på is og spinn ned Fjern opp...

I dette papiret gitt vi protokoller for analyse av redoks-avhengige Anstandsdame aktivitet og karakterisering av strukturelle endringer ved binding av en klient protein. Dette er supplerende metoder å definere potensielle Anstandsdame-underlaget komplekser og analysere potensielle samhandling områder.
Her brukt vi disse protokollene for karakterisering av en kompleks mellom redoks regulert Anstandsdame Hsp33 med et godt studert Anstandsdame substrat CS. Vi presentert to ulike typer protein a...

Celler støter ofte en opphopning av reaktive oksygen arter (ROS) som biprodukter åndedrett1,2, protein, lipid oksidasjon3,4og tilleggsprosesser5, 6,7. Til tross for ROS' fordelaktige rolle i ulike biologiske prosesser som cellular signal8,9 og immunrespons10, kan en ubalanse mellom ROS produksjon og dens avgiftning oppstå, fører til oksidativt understreke7. Biologiske mål for ROS er proteiner og lipider nucleic syrer, oksidasjon som påvirker deres struktur og funksjon. Derfor er akkumulering av mobilnettet oksidanter sterkt knyttet til en rekke ulike patologi inkludert kreft9,11, betennelse12,13og aldring14, 15, og har blitt funnet for å være involvert i starten og progresjon av nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers, Parkinsons og ALS sykdom16,17,18.
Både nylig syntetisert og modne proteiner er svært følsom for oksidasjon på grunn av de potensielt skadelige endringene av deres side kjeder, som forme proteiner struktur og funksjon19,20. Derfor fører oksidativt stress vanligvis til en utbredt protein inaktivering, misfolding og aggregering, til slutt fører til celledød. En av de elegante mobilnettet strategiene for å takle den potensielle skaden av protein oksidasjon er å benytte redoks-avhengige chaperones, som hemmer utbredt protein aggregering, i stedet for danner stabile kompleksene med misfolded klient proteiner21 ,22,23. Disse første linje forsvar chaperones aktiveres raskt som en områdespesifikk oksidasjon (vanligvis på cystein rester) at de konverteres til potent anti-aggregering molekyler24. Siden oksidativt stress resulterer i Hemming av åndedrett og nedgang i mobilnettet ATP nivåer25, er Kanonisk ATP-avhengige chaperones mindre effektive under oksidativt stress forhold25,26 ,27. Derfor redoks-aktivert ATP-uavhengig chaperones spiller en viktig rolle i å opprettholde protein homeostase ved akkumulering av oksidanter bakterier og eukaryoter (f.eks, Hsp3328 og RidA29 i bakterier, Get330 i gjær, peroxiredoxins31 i eukaryoter). Aktiviteten til disse chaperones avhenger sterkt reversibel strukturelle conformational forandringer indusert av en områdespesifikk oksidasjon som avdekker hydrofobe regioner involvert i anerkjennelse av misfolded klient proteiner.
Forskning av anti-aggregering mekanismen og prinsipper anerkjennelse av klienten proteiner av chaperones er ikke lett på grunn av dynamisk og heterogenic natur Anstandsdame-underlaget interaksjoner32,33, 34,35,36,37. Men stress regulert chaperones har en mulighet til å fremme vår forståelse av funksjonen anti-aggregering evne til å: 1) få to ulike former av Anstandsdame, aktiv (f.eksoksidert) og inaktiv (f.eks redusert), med introduksjon eller fjerning av en belastning enkelt bytte mellom dem (f.eks, oksiderende og redusere agent), 2) har en rekke forskjellige underlag, 3) utgjør svært stabile kompleksene med klienten proteiner som kan bli vurdert av ulike strukturelle metoder og 4) fokusere utelukkende på underlaget anerkjennelse og utgivelse, formidlet av redoks-avhengige conformational endringer, som fleste av disse chaperones mangler folding evnen.
Her analyserer vi den bakterielle redoks regulert Anstandsdame Hsp33's anti-aggregering aktivitet, en viktig komponent i den bakterielle forsvar mot oksidering-indusert protein aggregering28. Når redusert, er Hsp33 et tett foldet sink-bindende protein uten Anstandsdame aktivitet; imidlertid utsettes for oksidativt stress, gjennomgår Hsp33 omfattende conformational endringer som utsetter sin substrat bindende områder38,39. Ved oksidasjon er sink ion som er sterkt bundet til fire høyt konservert cystein rester av C-terminalen domenet utgitt40. Dette resulterer i dannelsen av to disulfide obligasjoner, en utfoldelse av C-terminalen domenet, og en destabilisering av de tilstøtende koblingsfunksjonalitet region41. Regionene C-terminalen og linker er svært fleksibel og er definert som egentlig eller delvis disordered. Ved retur til ikke forhold, cysteinene blir redusert og Anstandsdame tilbake til sin opprinnelige brettet tilstand uten anti-aggregering aktivitet. Refolding av Anstandsdame fører til en ytterligere unfolding og destabilization bundet klient protein, som utløser overtatt kanoniske Anstandsdame systemet, DnaK/J, for refolding38. Analyse av Hsp33's samhandling nettsteder antyder at Hsp33 benytter både sin ladet uordnede områder samt hydrofobe regionene på linker og N-terminal domene å fange misfolded klient proteiner og hindre deres aggregering38, 42. i foldet staten, disse områdene er skjult av brettet linker og C-terminalen domene. Interessant, fungerer regionen koblingsfunksjonalitet som en gatekeeper av Hsp33's foldet og inaktiv tilstand, "sensing" folding statusen sin ved C-terminalen domene34. Når ustabil av mutagenese (enten en punkt mutasjon eller en full sekvens forstyrrelsene), konverteres Hsp33 til en constitutively aktive Anstandsdame uansett redoks staten sin redoks-sensitive cysteinene43.
Protokollene presenteres her tillate overvåking av Hsp33's redoks-avhengige Anstandsdame aktivitet, samt kartlegging conformational endringer på aktivering og bindende klient proteiner. Denne metoden kan tilpasses til forskning andre Anstandsdame-klienten godkjenning modeller så vel som ikke-Anstandsdame protein-protein interaksjoner. Dessuten, presenterer vi protokoller for utarbeidelse av fullt redusert og oksidert chaperones som kan brukes i studier av andre redoks-bryteren proteiner, for å avsløre potensielle roller av protein oksidasjon på protein aktiviteten.
Spesielt vi beskriver en prosedyre for å overvåke Anstandsdame aktivitet i vitro og definere sine substrat spesifisitet under ulike typer protein aggregasjon (kjemisk eller termisk indusert) bruker lysspredning (LS) målt ved en fluorospectrometer44. Under aggregering, spredning lys på 360 nm øker raskt på grunn av den økende turbiditet. Dermed overvåkes aggregering i en tidsavhengige måte på denne bølgelengde. LS er en rask og følsom metode for protein aggregering og dermed anti-aggregering aktiviteten til et protein rundt med nanomolar konsentrasjoner, aktivere karakterisering av protein aggregering-relaterte kinetic parametere under forskjellige forhold. Videre LS protokollen beskrevet her krever ikke dyrt instrumentering, og lett kan opprettes i et laboratorium.
Likevel er det ganske utfordrende å få "ren" kinetic kurver og utlede et protein kinetic parametere fra slike lys spredning eksperimenter, støy og det store antallet outliers luftbobler og store mengder. For å overvinne denne hindringen, presenterer vi en ny grafisk verktøy, Kfits45, brukes for å redusere støy i ulike kinetic målinger, spesielt utstyrt for protein aggregering kinetic data. Denne programvaren gir foreløpige kinetic parametere for en tidlig vurdering av resultatene og lar brukeren "ren" store datamengder raskt uten å påvirke egenskapene kinetic. Kfits er implementert i Python og tilgjengelig i åpen kildekode 45.
En av de utfordrende spørsmålene i feltet gjelder kartlegging samhandling områder mellom chaperones og deres klient proteiner og forstå hvordan chaperones gjenkjenner en rekke misfolded underlag. Dette spørsmålet er mer komplisert når studere svært dynamisk protein komplekser som involverer egentlig disordered chaperones og aggregering utsatt underlag. Heldigvis strukturelle massespektrometri har dramatisk avansert det siste tiåret, og har klart å gi nyttige metoder og verktøy for å analysere strukturelle plastisitet og tilordne rester involvert i protein anerkjennelse46, 47 , 48 , 49. Her presenterer vi en slik teknikk-hydrogen-deuterium exchange massespektrometri (HDX-MS)-som tillater kartlegging av rester nivå endringer i en strukturell konformasjon ved protein endring eller protein/Ligand binding35, 50,,51,,52,,53,,54,,55. HDX-MS bruker kontinuerlig utveksling av ryggraden bygget av deuterium, frekvensen som påvirkes av kjemiske miljøet, tilgjengelighet og kovalente og ikke-kovalente bindinger56. HDX-MS sporer prosessene exchange bruker et deuterated løsemiddel, vanligvis tungtvann (D2O), og lar målingen basert på endringen i molekylvekt etter hydrogen deuterium Exchange. Lavere priser på hydrogen-deuterium exchange kan resultere fra bygget deltar i hydrogenbindinger, eller bare fra steric hinder, som angir lokale endringer i strukturen57. Endre på en ligand binding eller post-translasjonell modifikasjoner kan også føre til forskjeller i hydrogen miljø, med en binding som resulterer i forskjeller i hydrogen-deuterium exchange (HDX) priser46,53.
Vi brukt denne teknologien til 1) Hsp33 kartregioner som raskt utvikler seg ved oksidasjon, fører til aktivering av Hsp33, og 2) definerer potensielle bindende grensesnittet av Hsp33 med sin fulle misfolded underlaget, citrate syntase (CS)38.
Metodene som er beskrevet i dette manuskriptet kan brukes for å studere redoks-avhengige funksjoner proteinene i vitro, definere anti-aggregering aktivitet og rollen til strukturelle endringer (hvis noen) i protein-funksjonen. Disse metodene kan lett tilpasses ulike biologiske systemer og brukes i laboratoriet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1588px;" width="1588">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Chemicals, Reagents</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Acetonitrile HPLC plus</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34998-2.5L</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Methanol</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">76-05-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Water for HPLC</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnCl2, Zinc Chloride</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B0755416 308</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT</td>
			<td>goldbio</td>
			<td>27565-41-9</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PD mini trap G-25 columns GE healthcare</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-9180-07</td>
			<td>desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Phosphate</td>
			<td>United states Biochemical Corporation</td>
			<td>20274</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K46809910526</td>
			<td>oxidizing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">citrate synthase</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3260</td>
			<td>substrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES acid free</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7365-45-9</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gndcl</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3272-500G</td>
			<td>denaturant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Chloride Solution</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">543047-10G</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Oxide 99%</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">151882-100G</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td style="width:256px;">bioworld</td>
			<td style="width:119px;">42000058-2</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">150uL Micro-Insert with Mandrel Interior &#38; Polymer Feet, 29*5mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quartz cuvette</td>
			<td style="width:256px;">Hellma 101-QS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Instruments</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Jasco FP-8500 Fluorospectrometer</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:256px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13058/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">pH meter , PB-11 sartorius</td>
			<td style="width:256px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">13119/0</td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).</td>
			<td style="width:256px;">AffiPro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td>
			<td style="width:256px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door</td>
			<td style="width:256px;">COY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Q-exactive-orbitrap mass spectrometer</td>
			<td style="width:256px;">Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples</td>
			<td style="width:256px;">PAL system</td>
			<td colspan="2">https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex Ultimate 3000, XRS pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex AXP-MS auxiliary pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Software, Software Tools, Database search</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Kfits: Fit aggregation Data</td>
			<td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermo Scientific Xcalibur software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td>
			<td style="width:256px;">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Chronos software (Axel Semrau)</td>
			<td style="width:256px;">http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteome Discoverer V1.4 software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HDX workbench software</td>
			<td colspan="3">http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

Levende organismer må regelmessig takle varierende miljøer i løpet av livssyklusen, inkludert endringer i temperatur, pH, akkumulering av frie radikaler og mer. Disse svingningene kan føre til en utbredt protein unfolding, aggregering, og celle død. Derfor har celler utviklet et dynamisk og stress-spesifikke nettverk av molekylære chaperones, som opprettholde en "sunn" proteom under stress forhold. ATP-uavhengig chaperones utgjør en stor klasse av molekylære chaperones, som fungerer som første linje forsvar molekyler, beskytter mot protein samling på en stress-avhengige måte. En funksjon disse chaperones har felles er deres evne til å utnytte strukturelle plastisitet for stress-spesifikke aktivisering, anerkjennelse, og utgivelsen av misfolded klienten.
I dette papiret fokuserer vi på funksjonelle og strukturelle analysen av en slik egentlig uordnede Anstandsdame, bakteriell redoks regulert Hsp33, som beskytter proteiner mot aggregering under oksidativt stress. Her presenterer vi en verktøykasse ulike teknikker for å studere redoks regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging conformational endringer av Anstandsdame, underliggende sin virksomhet. Spesielt vi beskrive en arbeidsflyt som inkluderer utarbeidelse av fullt redusert og fullstendig oksidert proteiner, etterfulgt av en analyse av Anstandsdame anti-aggregering aktivitet i vitro bruker lys-spredning, med fokus på graden av den anti-aggregering aktivitet og dens kinetics. For å overvinne hyppige outliers akkumulert under aggregasjon analyser, beskriver vi bruken av Kfits, en ny grafisk verktøyet hvilke innrømmer enkel behandling av kinetic målinger. Dette verktøyet kan lett brukes på andre typer kinetic mål for fjerne outliers og passende kinetic parametere. Til relatere funksjonen med proteinstruktur, beskriver vi oppsett og arbeidsflyten en strukturell massespektrometri teknikk, hydrogen-deuterium exchange massespektrometri, som tillater kartlegging av conformational endringer på Anstandsdame og substrat under ulike stadier av Hsp33 aktivitet. Av samme metode kan brukes på andre protein-protein og protein-ligand interaksjoner.

De to metodene presentert gjør det mulig å følge den krevende aktivitet og dynamikken i protein interaksjoner mellom en Anstandsdame og dens substrat. Videre gjør reduksjon-oksidasjon protokollen at utarbeidelsen av en fullt redusert og fullstendig oksidert Anstandsdame, gir en mer grundig forståelse av aktivisering mekanisme redoks-avhengige uordnede chaperones.
Først brukte vi lysspredning undersøke redoks-avhengige akt...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definere Hsp33's Redox regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging Conformational endringer på Hsp33 med Hydrogen-deuterium Exchange massespektrometri

En av de mest utfordrende stress forholdene som organismer møte under sin levetid innebærer akkumulering av oksidanter. Under oksidativt stress avhengige celler tungt molekylær chaperones. Her presenterer vi metoder brukes til å undersøke redoks regulert anti-aggregering aktiviteten, samt for å overvåke strukturendringer styrer funksjonen Anstandsdame bruker HDX-MS.

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolasjon for Quantitative massespektrometri analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Fastsettelse av Protease spesifisitet i musen vev ekstrakter av MALDI-TOF massespektrometri: manipulere PH å forårsake spesifisitet endringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysere dynamisk Protein komplekser sammen på og løslatt fra Biolayer Interferometry Biosensor massespektrometri og elektronmikroskop

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En plasmaprøve forberedelse for massespektrometri ved hjelp av en automatisert arbeidsstasjon

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...