Name: defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry
Uploaded: 2018-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Yazarlar onun yararlı tartışmalar için Meytal Radzinski için müteşekkir ve kritik HDX analiz platformu kurmak onların sınırsız yardım için makale ve Patrick Griffin ve laboratuvar üyeleri için okuma. Yazarlar Almanca-İsrail Vakfı (ı-2332-1149.9/2012), iki uluslu Bilim Vakfı (2015056), Marie-Curie tümleştirme grant (618806), İsrail Bilim Vakfı için minnettar (1765/13 ve 2629/16) ve insan sınır bilim Mali destek programı (CDA00064/2014).

1. tam olarak azaltılmış ve tam okside proteinler hazırlanması
<ol><li>
Tam olarak azaltılmış bir protein hazırlanması Not: Burada, biz bir çinko içeren protein ve Zn dahil, düşük protein durumuna için kullanım ZnCl2 çözüm azalma tarif. ZnCl2 çözüm yerine atılan veya. Not zaman ve sıcaklık azaltma işleminin protein istikrar ve işlev bağlıdır ve böylece başına protein özgüdür.<ol>
<li>Protein örnek buz çözme ve Kaldır toplamları aşağı...

Bu yazıda, redoks bağımlı refakatçi etkinlik analizi ve yapısal değişiklikler bir istemci protein bağlama üzerine karakterizasyonu için protokolleri sağladı. Bu potansiyel refakatçi-substrat kompleksleri tanımlamak ve olası etkileşim siteleri çözümlemek için tamamlayıcı yöntemler vardır.
Burada, biz bu protokollerin iyi okudu refakatçi substrat CS ile redoks düzenlenir refakatçi Hsp33 arasında karmaşık bir karakterizasyonu için uygulanır. Biz onların kinetik v...

Hücreleri reaktif oksijen türleri (ROS) solunum1,2, protein ve lipit oksidasyon3,4ve ek işlemler5yan üretilen bir birikimi sık karşılaşırsanız, 6,7. ROS yararlı rolü rağmen8,9 ve bağışıklık yanıtı10sinyal cep gibi farklı biyolojik süreçleri, ROS üretim ve onun detoksifikasyon arasında bir dengesizlik, oksidatif için önde gelen ortaya çıkabilir 7stres. Biyolojik ROS, proteinler, lipidler ve nükleik asitler, bunların oksidasyon etkiler onların yapısı ve fonksiyonu hedefleridir. Bu nedenle, hücresel oksidanlar birikimi güçlü patolojiler kanser9,11, iltihap12,13ve yaşlanma14, de dahil olmak üzere çeşitli bir yelpazede bağlı olduğu 15ve başlangıçlı ve nörodejeneratif hastalıklar gibi Alzheimer, Parkinson'ın ilerlemesini ve ALS hastalığı16,17,18dahil olduğu tespit edilmiştir.
Hem yeni sentezlenmiş ve olgun protein oksidasyon protein yapısı ve fonksiyonu19,20şekil onların yan zincirlerinin zararlı olabilecek değişiklikler nedeniyle son derece duyarlıdır. Bu nedenle, oksidatif stres genellikle yaygın protein inactivation, misfolding ve toplama, sonunda hücre ölümüne giden yol açar. Protein oksidasyon olabilecek hasarları ile başa çıkmak için zarif hücresel stratejilerden birini yerine misfolded istemci protein21 ile kararlı kompleksler kurma yaygın protein toplama, inhibe redoks bağımlı chaperones kullanmaktır ,22,23. Bu ilk satır savunma chaperones hızla bunları güçlü anti-toplama molekülleri24dönüştürür bir siteye özgü oksidasyon (genellikle üzerinde sistein kalıntıları) tarafından etkinleştirilir. Oksidatif stres sonuçlar solunum inhibisyonu ve hücresel ATP düzeyleri25düşüşler beri kurallı ATP-bağımlı chaperones oksidatif stres koşulları25,26 sırasında daha az etkili ,27. Bu nedenle, redoks aktif ATP bağımsız chaperones oksidanlar bakteri ve ökaryotlar birikimi üzerine protein homeostazı korumak hayati bir rol oynamaktadır (Örneğin, Hsp3328 ve bakterilerde, Get3 RidA29 30 Maya, peroxiredoxins31 ökaryotlarda içinde). Bu chaperones etkinlik şiddetle hidrofobik bölgeler misfolded istemci proteinler tanıma dahil ortaya çıkaran bir siteye özgü oksidasyon tarafından indüklenen tersine çevrilebilir yapısal konformasyon değişiklikler bağlıdır.
Anti-toplama mekanizması ve istemci proteinler tanınması chaperones tarafından yöneten ilkeleri araştırma refakatçi-substrat etkileşimleri32,33dinamik ve heterogenic yapısı nedeniyle kolay değil, 34,35,36,37. Ancak, stres düzenlenir chaperones anti-toplama işlevi nedeniyle onların yetenek-e doğru bizim anlayışı ilerletmek için bir fırsat var: 1) refakatçi, (oksideÖrneğin,) etkin ve etkin olmayan (Örneğin, iki farklı türde elde giriş veya kolayca (Örneğin, oksidan ve indirgeyici), aralarında 2 geçiş bir stres durumu kaldırılması ile azaltılmış,)) yüzeyler, 3 geniş bir yelpazesi var) tarafından değerlendirilecek istemci proteinler ile son derece kararlı kompleksler oluşturur farklı yapısal metodolojisi ve 4) yalnızca substrat tanıma ve açıklaması, bu chaperones çoğunluğu katlama yeteneği yoksun olarak redoks bağımlı konformasyon değişikliklerden aracılı üzerinde odaklanmak.
Burada, bakteriyel redoks düzenlenir refakatçi Hsp33'ın anti-toplama etkinliği, oksidasyon kaynaklı protein toplama28karşı bakteriyel savunma sisteminin önemli bir bileşeni analiz. Azaltılmış, Hsp33 sıkıca katlanmış bir çinko-bağlayıcı protein hiçbir refakatçi etkinlik ile olur; Ancak, oksidatif strese maruz kaldığında, Hsp33, substrat bağlama bölgeleri38,39maruz kapsamlı konformasyon değişiklikler uğrar. Oksidasyon, C-terminal etki alanı dört son derece korunmuş sistein kalıntıları kuvvetle bağlı çinko iyon yayımlanan40olur. Bu iki disülfür bağları, bir C-terminal etki alanı ve bir istikrarsızlık bitişik bağlayıcı bölge41unfolding oluşumunda sonuçlanır. C-terminal ve bağlayıcı bölgeleri son derece esnektir ve özünde veya kısmen düzensiz olarak tanımlanır. Sigara stres koşulları döndüğünde, katıldı sınırlı olmak ve refakatçi hiçbir anti-toplama etkinlik ile yerel katlanmış durumuna döndürür. Refakatçi refolding daha fazla unfolding için yol açar ve refolding38için kanonik refakatçi sistem, DnaK/J, onun transfer tetikler ilişkili istemci protein destabilization. Onun dolu düzensiz bölgeler hem de hidrofobik bölgeler bağlayıcı ve N-terminal etki alanı yakalamak için Hsp33 kullanan her iki istemci proteinler misfolded ve önlemek onların toplama38, analiz Hsp33'ın etkileşim sitelerin öneriyor 42. katlanmış durumda katlanmış bağlayıcı ve C-terminal etki alanı tarafından bu bölgeler gizlidir. İlginçtir, bağlayıcı bölge "onun bitişik C-terminal etki alanı34katlama durumunu algılama" bir ağ geçidi denetleyicisi Hsp33'ın devletin, katlanmış ve etkin değil hizmet vermektedir. Bir kez mutagenesis (ya bir nokta mutasyon veya tam sırası pertürbasyon) tarafından dengeleri bozdu, Hsp33 bir yapısal etkin refakatçi ne olursa olsun onun redoks duyarlı katıldı43redoks durumunu dönüştürülür.
Burada sunulan iletişim kurallarına izin ver Hsp33'ın redoks bağımlı refakatçi etkinlik, yanı sıra etkinleştirme üzerine eşleme konformasyon değişiklikleri izleme ve istemci proteinlerin bağlama. Bu yöntem diğer refakatçi-müşteri tanıma modelleri yanı sıra refakatçi protein-protein etkileşimleri araştırma için adapte edilebilir. Ayrıca, biz potansiyel rolleri protein oksidasyon protein etkinlikte ortaya çıkarmak için başka redoks-anahtarı proteinlere çalışmalarında kullanılan tam olarak azaltılmış ve okside chaperones hazırlanması için protokolleri mevcut.
Özellikle, refakatçi etkinlik vitro izlemek ve onun substrat özgüllüğü (kimyasal olarak veya termal olarak ışık saçılma (LS) tarafından ölçülen kullanarak indüklenen) protein toplayıcı farklı türleri altında tanımlamak için bir yordam tarif bir fluorospectrometer44. Toplama sırasında hızla artan bulanıklık nedeniyle 360 nm artar, ışık saçılma. Böylece, toplama, bu dalga boyu bir saat-bağımlı şekilde izlenebilir. MU var protein toplama ve böylece bir protein nanomolar konsantrasyonları, protein toplama ile ilgili kinetik parametreleri altında farklı karakterizasyonu etkinleştirme kullanarak ilgi anti-toplama etkinliğini test etmek için hızlı ve hassas bir yöntem koşullar. Ayrıca, burada açıklanan LS Protokolü pahalı araçları gerektirmez ve kolayca herhangi bir laboratuvar olarak kurulabilir.
Yine de, "temiz" Kinetik eğriler elde etmek için ve deneyler, gürültü ve hava kabarcıkları ve büyük toplamları tarafından oluşturulan aykırı çok sayıda nedeniyle saçılma böyle ışık protein kinetik parametrelerin türetmek için oldukça zor. Bu engeli aşmak için biz mevcut bir roman grafik aracı, Kfits45gürültü seviyeleri özellikle protein toplama kinetik verileri için donatılmış farklı kinetik ölçümlerde azaltmak için kullanılan. Bu yazılım ön kinetik parametrelerin sonuçları erken bir değerlendirmesi için sağlar ve kullanıcının veri büyük miktarlarda hızlı bir şekilde kinetik özelliklerini etkilemeden temiz"". Kfits uygulanan Python ve 45açık kaynak mevcuttur.
Alanında zor sorulardan biri etkileşim siteleri chaperones ve onların istemci proteinler arasında eşleme ve nasıl tanımak chaperones misfolded yüzeylerde geniş bir anlama ile ilgilidir. Bu soruyu daha da özünde dahil son derece dinamik protein kompleksleri eğitim chaperones ve toplama eğilimli yüzeylerde düzensiz zaman karmaşık. Neyse ki, yapısal kütle spektrometresi son on yıl içinde önemli ölçüde ilerlemiştir ve başarılı bir şekilde yararlı yaklaşımlar ve yapısal plastisite analiz ve artıkları protein tanıma46, yer alan eşlemek için araçları sağlamıştır 47 , 48 , 49. burada, bir tür tekniği-hidrojen-döteryum Satım kütle spektrometresi (HDX-MS) mevcut-protein ve/veya protein/Ligand bağlayıcı35, üzerine yapısal bir biçimsel kalıntı düzeyinde yapılan değişiklikler eşleme sağlar 50,51,52,53,54,55. HDX-MS tarafından döteryum, hangi oranı kimyasal çevre tarafından erişilebilirlik, etkilenen omurga hidrojen sürekli değişimi kullanır ve kovalent ve Kovalent bağlar56. HDX-MS deuterated solvent, yaygın olarak "ağır su" (D2O) kullanarak bu satım işlemleri izler ve moleküler hidrojen döteryum Exchange'e takip ağırlık değişiklik dayalı ölçüm sağlar. Hidrojen-döteryum değişiminin daha yavaş gore hidrojen hidrojen bağları katılan veya, yerel değişikliklerde sonuçlanırsa yapısı57gösterir sadece, steric engel neden olabilir. Değişiklikleri bir ligand bağlayıcı veya translasyonel modifikasyon üzerine de farklılıklar hidrojen ortamda hidrojen-döteryum exchange (HDX) oranları46,53farklılıkları sonuçlanan bir bağlama ile yol açabilir.
Biz bu teknoloji hızla Hsp33, harekete geçirmek için önde gelen oksidasyon, üzerine açılmak ve 2) tanımlamak Hsp33 olası bağlama arayüzü, tam uzunlukta misfolded substrat, sitrat sentaz (CS)38ile 1) harita Hsp33 bölgelere uygulanır.
Bu el yazması açıklanan yöntemleri proteinler vitroanti-toplama etkinliği ve yapısal değişiklikler rolü (varsa) protein işlevinde tanımlama, redoks-bağımlı işlevler çalışmaya uygulanır. Bu metodolojileri kolayca farklı biyolojik sistemleri için uyarlanmış ve laboratuvar olarak uygulanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1588px;" width="1588">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Chemicals, Reagents</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Acetonitrile HPLC plus</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34998-2.5L</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Methanol</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">76-05-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Water for HPLC</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZnCl2, Zinc Chloride</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">B0755416 308</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT</td>
			<td>goldbio</td>
			<td>27565-41-9</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PD mini trap G-25 columns GE healthcare</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-9180-07</td>
			<td>desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Phosphate</td>
			<td>United states Biochemical Corporation</td>
			<td>20274</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td style="width:256px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K46809910526</td>
			<td>oxidizing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">citrate synthase</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C3260</td>
			<td>substrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES acid free</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7365-45-9</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gndcl</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3272-500G</td>
			<td>denaturant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Chloride Solution</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">543047-10G</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deuterium Oxide 99%</td>
			<td style="width:256px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">151882-100G</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td style="width:256px;">bioworld</td>
			<td style="width:119px;">42000058-2</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">150uL Micro-Insert with Mandrel Interior &#38; Polymer Feet, 29*5mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm</td>
			<td style="width:256px;">La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quartz cuvette</td>
			<td style="width:256px;">Hellma 101-QS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Instruments</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Jasco FP-8500 Fluorospectrometer</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:256px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13058/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">pH meter , PB-11 sartorius</td>
			<td style="width:256px;">Sartorius</td>
			<td style="width:119px;">13119/0</td>
			<td style="width:421px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).</td>
			<td style="width:256px;">AffiPro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx5mm)</td>
			<td style="width:256px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 &#197;, 1.7um, 2.1mmx50mm)</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door</td>
			<td style="width:256px;">COY</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:792px;">Q-exactive-orbitrap mass spectrometer</td>
			<td style="width:256px;">Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples</td>
			<td style="width:256px;">PAL system</td>
			<td colspan="2">https://www.palsystem.com/index.php?id=840</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex Ultimate 3000, XRS pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:792px;">Dionex AXP-MS auxiliary pump</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:792px;">Software, Software Tools, Database search</td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:792px;">Kfits: Fit aggregation Data</td>
			<td>http://kfits.reichmannlab.com/fitter/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thermo Scientific Xcalibur software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)</td>
			<td style="width:256px;">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Chronos software (Axel Semrau)</td>
			<td style="width:256px;">http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteome Discoverer V1.4 software</td>
			<td style="width:256px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HDX workbench software</td>
			<td colspan="3">http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining hsp33's redox-regulated chaperone activity and mapping conformational changes on hsp33 using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry

Canlı organizmalar düzenli olarak dalgalanan ortamları ile sıcaklık, pH, reaktif oksijen türleri birikimi, daha fazla ve değişiklikleri de dahil olmak üzere kendi yaşam döngüsü sırasında başa çıkmak gerekir. Bu dalgalanmalar unfolding, bir yaygın protein için toplama, kurşun ve ölüm hücre. Bu nedenle, hücreleri "sağlıklı" Proteom stres koşullarında korumak moleküler chaperones dinamik ve stres özel ağının gelişmiştir. ATP bağımsız chaperones ilk satır savunma molekülleri, bir stres bağlı şekilde protein toplama karşı koruma olarak hizmet moleküler chaperones bir ana sınıfı oluşturur. Bu chaperones ortak olan bir özelliği yeteneğini kendi stres özgü etkinleştirme, tanıma ve misfolded istemci sürümü için yapısal plastisite kullanmak olmasıdır.
Bu yazıda, bir tür özünde düzensiz refakatçi, bakteriyel redoks düzenlenir Hsp33, proteinler oksidatif stres sırasında toplama karşı koruyan fonksiyonel ve yapısal analizi odaklanmak. Burada, kendi faaliyet altında yatan bir araç çeşitli teknikleri redoks düzenlenir refakatçi etkinlik eğitim için hem de refakatçi konformasyon değişiklikleri eşleştirmek için mevcut. Özellikle, biz tam olarak azaltılmış ve tam okside proteinler, ışık saçılım kullanarak, derecesi üzerinde odaklanan refakatçi anti-toplama etkinliği vitro analizine ardından hazırlanması içeren bir iş akışı tarif Anti-toplama etkinliği ve onun kinetik. Sık outliers toplama deneyleri sırasında biriken üstesinden gelmek için Kfits, kinetik ölçümleri kolay işlenmesini sağlayan yeni bir grafik araç kullanımını açıklar. Bu aracı kolayca diğer türleri kinetik ölçümlerin outliers kaldırma ve kinetik parametrelerin montaj için uygulanabilir. Işlev protein yapısı ile ilişkilendirmek için kurulum ve iş akışı bir yapısal kütle spektrometresi tekniği, refakatçi eşleme konformasyon değişikliklerinin sağlayan hidrojen-döteryum Satım kütle spektrometresi, tarif ve Hsp33 faaliyet farklı aşamalarında alt katman. Aynı metodoloji diğer protein-protein ve protein-ligand etkileşimleri için uygulanabilir.

Sunulan iki yöntem kinetik etkinlik ve protein etkileşimleri, substrat arasındaki bir koruyucuya dinamikleri takip olanak sağlar. Ayrıca, oksidasyon azaltma Protokolü redoks bağımlı düzensiz chaperones etkinleştirme mekanizması daha derinlemesine bir anlayış vererek bir tam olarak azaltılmış ve tam okside koruyucuya hazırlanması sağlayan.
İlk olarak, ışık saçılma refakatçi redoks bağımlı etkinliğin...

Watch this Scientific Journal Video about Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry at JoVE.co

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Organizmalar hayatları boyunca karşılaştığınız en zor stres koşulları oksidanlar birikimi içerir. Oksidatif stres sırasında hücreleri moleküler chaperones güveniyorsun. Burada, redoks düzenlenir anti-toplama etkinliği, de araştırmak için refakatçi işlev HDX-MS kullanarak yöneten yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan bir yöntem mevcut.

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Otomatik İş İstasyonu Kullanarak Kütle Spektrometresi Için Plazma Numune Spektrometresi Hazırlığı

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...