Name: high-resolution comparison of bacterial conjugation frequencies
Uploaded: 2019-01-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies at JoVE.com

Wij danken Dr. K. Kamachi van het National Institute of Infectious Diseases (Japan) voor het verstrekken van pBP136 en Prof. Dr. H. Nojiri van de Universiteit van Tokio (Japan) voor het verstrekken van pCAR1. Wij zijn ook dankbaar Professor Dr. Molin Sølen van de Technische Universiteit van Denemarken voor het verstrekken van pJBA28. Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI (Grant nummers 15H 05618 en 15KK0278) aan MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

1. bereiding van een Donor met groen fluorescente proteïne (GFP)- en kanamycine resistentie gen-gelabeld plasmiden
<ol><li>Binnenbrengen van de pBP136 van de plasmide doel van markers Opmerking: Het doel van dit protocol is het genereren van pBP136::gfp. De bacteriestammen en plasmiden gebruikt in dit onderzoek zijn vermeld in tabel 1.<ol>
<li>Culturen van Escherichia coli DH10B pBP13617 in 5 mL steriele Luria Boui...

<ol>
	<li>Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+integrated+model+of+bacterial+conjugation.">Towards an integrated model of bacterial conjugation.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).</li><li>Johnson, C. M., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+and+conjugative+elements+(ICEs):+what+they+do+and+how+they+work.">Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work.</a> Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).</li><li>Garcill&#225;n-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+bacterial+plasmids+based+on+mobility+and+plasmid+population+biology.">Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).</li><li>Smillie, C., Garcill&#225;n-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+plasmids.">Mobility of plasmids.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).</li><li>Garcill&#225;n-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+conjugative+relaxases+and+its+application+in+plasmid+classification.">The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).</li><li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+range+of+IncP-7+conjugative+plasmid+pCAR2+from+Pseudomonas+putida+HS01+is+broader+than+from+other+Pseudomonas+strains.">Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains.</a> Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).</li><li>Yanagida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+the+transferability+of+plasmids+pCAR1,+pB10,+R388,+and+NAH7+among+Pseudomonas+putida+at+different+cell+densities.">Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).</li><li>Schuurmans, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+growth+rate+and+selection+pressure+on+rates+of+transfer+of+an+antibiotic+resistance+plasmid+between+E.+coli+strains.">Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains.</a> Plasmid. 72, 1-8 (2014).</li><li>Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+surface+mating+systems+among+conjugative+drug+resistance+plasmids+in+Escherichia+coli+K-12.">Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12.</a> Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).</li><li>Nakazawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+transferability+of+incompatibility+(Inc)+P-7+plasmid+pCAR1+and+IncP-1+plasmid+pBP136+in+stirring+liquid+conditions.">Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions.</a> PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).</li><li>Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ecological+factors+on+conjugal+transfer+of+chromium-resistant+plasmid+in+Escherichia+coli+isolated+from+tannery+effluent.">Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).</li><li>Sakuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divalent+cations+increase+the+conjugation+efficiency+of+the+incompatibility+P-7+group+plasmid+pCAR1+among+different+Pseudomonas+hosts.">Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts.</a> Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).</li><li>Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-plasmid+transfer+to+and+from+Escherichia+coli+strains+Isolated+from+human+fecal+samples.">R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).</li><li>Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+mating+pair+formation+in+plasmid+population+dynamics.">Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics.</a> Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).</li><li>Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytology+of+bacterial+conjugation.">The cytology of bacterial conjugation.</a> EcoSal Plus. 2004, (2004).</li><li>Minoia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+bistability+in+horizontal+transfer+control+of+a+genomic+island+in+Pseudomonas.">Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).</li><li>Kamachi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+pBP136+from+Bordetella+pertussis+represents+an+ancestral+form+of+IncP-1beta+plasmids+without+accessory+mobile+elements.">Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements.</a> Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).</li><li>Simon, R., Priefer, U., P&#252;hler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad+host+range+mobilization+system+for+in+vivo+genetic+engineering:+transposon+mutagenesis+in+gram+negative+bacteria.">A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria.</a> Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).</li><li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+replication,+maintenance,+and+transfer+features+of+the+IncP-7+plasmid+pCAR1,+which+carries+genes+involved+in+carbazole+and+dioxin+degradation.">Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).</li><li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+revealed+transfer+ranges+of+IncP-1,+IncP-7,+and+IncP-9+plasmids+in+a+soil+bacterial+community.">Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).</li><li>Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconsideration+of+the+derivation+of+most+probable+numbers,+their+standard+deviations,+confidence+bounds+and+rarity+values.">Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values.</a> Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).</li><li>Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+horizontal+transfer+of+mobile+genetic+elements.">In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements.</a> FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).</li><li>Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+vectors+containing+non-antibiotic+resistance+selection+markers+for+cloning+and+stable+chromosomal+insertion+of+foreign+genes+in+gram-negative+bacteria.">Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).</li><li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range,+high+copy+number,+RSF1010-derived+vectors,+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas.">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li><li>Maeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+nucleotide+sequence+of+carbazole/dioxin-degrading+plasmid+pCAR1+in+Pseudomonas+resinovorans+strain+CA10+indicates+its+mosaicity+and+the+presence+of+large+catabolic+transposon+Tn4676.">Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676.</a> Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).</li><li>Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+pCAR2:+pCAR2+and+pCAR1+were+structurally+identical+IncP-7+carbazole+degradative+plasmids.">The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).</li></ol>

Hier presenteren we een high-resolution protocol voor de detectie van verschillen in vervoeging frequentie onder verschillende omstandigheden, gebruik een MPN-methode voor de raming van het aantal transconjugants. Een belangrijke stap in het protocol is het verdunnen van het mengsel van donor en ontvanger na de paring tot geen transconjugants groeien. Een andere stap is het toevoegen van hoge concentraties van antibiotica aan de selectieve vloeistof om te voorkomen dat verdere Woordherkomst en-opbouw. Deze procedures kun...

Bacteriële vervoeging van mobiele genetische elementen, conjugative plasmiden en integratieve en conjugative elementen (ICEs) is belangrijk voor de horizontale verspreiding van genetische informatie. Het kan bevorderen snelle bacteriële evolutie en aanpassing en overbrengen van multidrug resistentie genen1,2. De vervoeging frequentie kan worden beïnvloed door eiwitten gecodeerd op de conjugative elementen voor mobilisatie van DNA (MOB) en de paring paar vorming (MPF), met inbegrip van geslacht pili, die zijn ingedeeld volgens MOB en MPF type3,,4, 5. Het kan ook worden beïnvloed door de donor en ontvanger paar6 en de voorwaarden van de groei van de cellen7,8,9,10,11,12 ( groeitempo op jaarbasis, celdichtheid, stevige ondergrond of opgietvloeistof, temperatuur, beschikbaarheid van nutriënten en de aanwezigheid van kationen). Om te begrijpen hoe de conjugative elementen verspreid onder bacteriën, is het noodzakelijk om te vergelijken vervoeging frequentie in detail.
De vervoeging frequentie tussen donor en ontvanger paren na de paring worden meestal als volgt geschat door conventionele methoden. (i) ten eerste, het aantal kolonies van donor en ontvanger worden geteld; (ii) dan worden de ontvangende kolonies, waaraan de conjugative elementen (= transconjugants) geteld; (iii) en ten slotte de vervoeging frequentie wordt berekend door de kolonievormende eenheden (kve) van de transconjugants door die van de donor en/of ontvanger13. Wanneer u deze methode gebruikt, is de achtergrond echter hoog als gevolg van extra vervoeging gebeurtenissen die ook op de selectieve platen gebruikt plaatsvinden kunnen voor het verkrijgen van transconjugants wanneer de celdichtheid hoge10is. Het is daarom moeilijk te detecteren van kleine verschillen in frequentie (onder een 10-fold verschil). We introduceerde onlangs een meest waarschijnlijke aantal (MPN) methode met behulp van vloeibaar medium met een hogere concentratie van antibiotica. Hierdoor verminderd de achtergrond door remming van verdere vervoeging in het selectieve medium; Dus, de vervoeging frequentie kan worden geraamd met een hogere resolutie.
Vervoeging kan worden onderverdeeld in drie stappen: (1) bevestiging van de donor-ontvanger paar (2) opening van conjugative overdracht, en (3) dissociatie van het paar14. Tijdens stap (1) en (3) is er fysieke interactie tussen de donor en de ontvanger cellen; Dus, celdichtheid en de milieuomstandigheden kunnen invloed op deze stappen, hoewel de kenmerken van het geslacht pili ook belangrijk zijn. Stap (2) is waarschijnlijk geregeld door de expressie van verschillende genen die betrokken zijn bij de vervoeging in reactie op externe veranderingen, die kunnen worden beïnvloed door verschillende functies van de plasmide, donor en ontvanger. Hoewel de fysieke bijlage of detachement van donor en ontvanger paren kan worden wiskundig gesimuleerd met behulp van een schatting van cellen als deeltjes, worden de frequentie van de stap (2) experimenteel gemeten. Er zijn een paar verslagen over directe waarnemingen van hoe vaak donoren kunnen dit leiden tot vervoeging [stap (2)] met behulp van fluorescentie microscopie15,16; deze methoden zijn echter niet high-throughput omdat een groot aantal cellen moet worden gecontroleerd. Dus, wij een nieuwe methode ontwikkeld om schatting van de waarschijnlijkheid van het optreden van de stap (2) met behulp van fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS). Onze methode kan worden toegepast op elke plasmide, zonder identificatie van de essentiële genen voor Woordherkomst en-opbouw.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlow</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8599600</td>
			<td>Sheath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospheres (10 &#956;m)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>beads to set up the FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Yamato Scientific Co. Ltd</td>
			<td>211197-IC802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer UV-1800</td>
			<td>SIMADZU Corporation</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>NIPPON Genetics Co, Ltd</td>
			<td>TR5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate type Petri dish</td>
			<td>AXEL</td>
			<td>1-9668-01</td>
			<td>for validation of sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>C045A025A</td>
			<td>for filter mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pippettes</td>
			<td>Nichiryo CO. Ltd</td>
			<td>00-NPX2-20, 
			00-NPX2-200, 
			00-NPX2-1000</td>
			<td>0.5-10 &#956;L, 20-200 &#956;L, 100-1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-channel pippetes</td>
			<td>Nichiryo CO. Ltd</td>
			<td>00-NPM-8VP, 
			00-NPM-8LP</td>
			<td>0.5-10 &#956;L, 20-200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01162-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>077-02974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>115-00342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>AXEL</td>
			<td>3-1491-51</td>
			<td>JPND90-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes</td>
			<td>Fukaekasei</td>
			<td>131-815C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL disposable spinner flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution comparison of bacterial conjugation frequencies

Bacteriële conjugatie is een belangrijke stap in de horizontale overdracht van antibiotica-resistentiegenen via een conjugative DNA-element. Diepgaande vergelijkingen van geconjugeerde frequentie onder verschillende omstandigheden moeten begrijpen hoe verspreidt het conjugative element in de natuur. Conventionele methodes voor het vergelijken van geconjugeerde frequentie zijn echter niet geschikt voor diepgaande vergelijkingen vanwege de hoge achtergrond veroorzaakt door extra vervoeging gebeurtenissen op de selectieve plaat. We verlaagd met succes de achtergrond door de invoering van een meest waarschijnlijke aantal (MPN) methode en een hogere concentratie van antibiotica ter voorkoming van verdere vervoeging in selectieve vloeistof. Daarnaast ontwikkelden we een protocol voor het inschatten van de kans op hoe vaak donor cellen starten vervoeging gesorteerd enkele donor cellen in ontvangende zwembaden door fluorescentie-activated cell sorting (FACS). Met behulp van twee plasmiden, kon pBP136 en pCAR1, de verschillen in de frequentie van de vervoeging in Pseudomonas putida cellen worden opgespoord in vloeistof tegen verschillende opzwepende tarieven. De frequenties van geconjugeerde Inleiding waren hoger voor pBP136 dan voor pCAR1. Met deze resultaten, kunnen we beter de functies van de vervoeging in deze twee plasmiden begrijpen.

Vergelijking van geconjugeerde frequentie door de MPN-methode
In ons vorige verslag, vergeleken we de frequenties van de vervoeging van pBP136::gfp en pCAR1::gfp in drievoudige verdunde LB (1/3 LB) vloeistof met verschillende opzwepende tarieven na een 45 min paring met 125 mL spinner kolven10. We vergeleken de frequenties van de vervoeging van pBP136::gfp en pCAR1::gfp me...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies at JoVE.com

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Hoge resolutie vergelijking van bacteriële vervoeging frequenties

Met een doel te begrijpen van het gedrag van verschillende bacteriële conjugative DNA elementen onder verschillende omstandigheden, beschrijven we een protocol voor de detectie van verschillen in de frequentie van de conjugatie, met een hoge resolutie te schatten hoe efficiënt de donor-bacterie met deze opdracht start Woordherkomst en-opbouw.

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de microbiologie veld over hoe vaak plasmiDE DNA kan worden verspreid onder verschillende bacteriën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door het verminderen van de achtergrond, kunnen we kleine verschillen in de vervoegingsfrequentie met een hoge resolutie detecteren. Het aantonen van de procedure zal Kosuke Yanagiya, een afgestudeerde student van mijn laboratorium.Om de vervoegingsfrequentie te berekenen aan de meest waarschijnlijke getal, filtert u een milliliter uit een nachtelijke donorcultuur met één milliliter uit een nachtontvangercultuur gedurende 45 minuten bij 30 graden Celsius, zoals zojuist is aangetoond. Terwijl de co-cultuur is uitbroeden, serieel verdunnen van de oorspronkelijke donor en ontvanger culturen voor plating in drievoud op donor Luria bouillon, of LB, plus kanamycine, of ontvanger LB plus gentamycine platen voor een twee-daagse cultuur op 30 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, resuspend de cultuur op het filter in steriele LB met kanamycine en gentamycine voor seriële verdunning in een 96-bron celkweekplaat in quadruplicate.Tel na twee dagen bij 30 graden Celsius handmatig de kolonievormende eenheden, of CFU's, op de donor- en ontvanger agarplaten en het aantal putten waarin de transconjuganten groeien door lichte microscopie. Open het MPN-berekeningsprogramma om het meest waarschijnlijke getal en de afwijking ervan te berekenen. Voer de naam en datum van het experiment, het aantal van de testreeks en het maximum aantal verdunningen in rij zeven van het programmablad van het spreadsheetbestand in.Voer in de automatisch geproduceerde invoergegevenstabellen de formule in de kolom verdunningsfactor D in, 0,01 in het volume in milliliters of GW-kolom en vier in het aantal kolommen met buizen N. Voer het aantal putten in waarin de transconjuganten bij elke monsterverdunning groeiden en klik op het berekenen van de resultaten als het meest waarschijnlijke aantal per milliliter, en de bovenste en onderste 95%-betrouwbaarheidslimieten. Verdeel vervolgens het aantal transconjuganten door het aantal donor- en ontvangende kolonievormende eenheden per milliliter om de vervoegingsfrequentie van de plasmiden te berekenen.In dit representatieve experiment steeg de vervoegingsfrequentie van beide plasmiden bij hogere roersnelheden met een maximaal verschil in vervoegingsfrequentie waargenomen tussen nul en 400 rpm voor culturen die zijn geïntroduceerd bij de pBP136:gfp plasmid, en tussen nul en 200 rpm voor culturen die werden geïntroduceerd in de pCAR1:gfp plasmid. Om de dichtheid van de ontvangende cellen te bepalen die nodig zijn om de waarschijnlijkheid van vervoeging te vergelijken, werden paringstesten uitgevoerd met verschillende donor- en ontvangerdichtheden. In dit representatieve experiment werden pBP136:gfp transconjuganten ontdekt in 100% van de putten die één keer 10 tot de derde CFU van donor bevatten en één keer 10 tot de vijfde tot één keer 10 tot de zevende CFU van ontvanger, en die met één keer 10 tot de tweede CFU van donor en één keer 10 tot de zesde tot de zesde tot de zevende CFU ontvanger van de ontvanger van de , wat aangeeft dat de celdichtheid te hoog was.Paringstesten met 10 CFU van donor en 10 tot de zesde of 10 tot de vijfde CFU van de ontvanger, resulteerde echter in een verminderd aantal transconjugant positieve putten. Zo werd voorspeld dat 10 tot de vijfde CFU van de ontvanger nodig zou zijn voor de paring met een enkele donorcel. Paringstesten met pCAR1:gfp bij verschillende dichtheden van donor- en ontvangerstammen toonden vergelijkbare bevindingen aan, hoewel over het algemeen de percentages transconjugant positieve putten veel lager waren dan die van pBP136:gfp.Ervan uitgaande dat de donor- en ontvangercellen zich op dezelfde manier aan elkaar kunnen hechten, was de kans op vervoegingsinitiatie voor de pCAR1-donor lager dan die voor de pBP136-donor. Op basis van deze resultaten werd geschat dat 10 tot de zevende CFU van de ontvanger nodig was voor een enkele donorcel gesorteerd op FACS. Na het tellen van de aantallen transconjugant positieve putten, werd het percentage transconjugant positieve putten voor pBP136:gfp bepaald om groter te zijn dan dat voor pCAR1:gfp, het aantonen van een meer dan 36-voudig verschil in de waarschijnlijkheid van donor geïnitieerde vervoeging tussen deze twee plasmiden.Tijdens een poging tot de procedure, is het belangrijk om te onthouden om altijd verdunnen van de bacteriële mengsels zorgvuldig.

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Hoge resolutie smeltende PCR voor Complement Receptor 1 Lengte Polymorfisme Genotypering: Een Innovatief Gereedschap voor Alzheimer&#39;s Ziekte Geneesbaarheid Beoordeling

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor Capture Hi-C: High-resolution, genoom-brede profilering van promotor interacties

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificeren van mutaties door een hoge resolutie smelting in een TILLING populatie van rijst

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformatie gevolgd door inenting met Ralstonia Solanacearum voor eenvoudige genetische analyse van bacteriële wilt ziekte

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...