Name: high-resolution comparison of bacterial conjugation frequencies
Uploaded: 2019-01-10T13:00:00
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pCAR1 प्रदान करने के लिए टोक्यो विश्वविद्यालय (जापान) के pBP136 और प्रो डॉ एच Nojiri प्रदान करने के लिए हम राष्ट्रीय संक्रामक रोग संस्थान (जापान) के कमाची डॉ. हम pJBA28 प्रदान करने के लिए डेनमार्क के तकनीकी विश्वविद्यालय के प्रोफेसर डॉ Molin Sølen के भी आभारी हैं. इस काम को JSPS KAKENHI (ग्रांट नंबर्स 15H05618 और 15KK0278) ने एमएस (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/) को सपोर्ट किया था ।

1. ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक दाता की तैयारी (GFP)-और कनमीसिन प्रतिरोध जीन-टैग Plasmids
<ol><li>लक्ष्य प्लाज्मिड pBP136 में मार्कर जीन का परिचय नोट: इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य pBP136 उत्पंन करने के लिए ?...

<ol>
	<li>Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+integrated+model+of+bacterial+conjugation.">Towards an integrated model of bacterial conjugation.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).</li><li>Johnson, C. M., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+and+conjugative+elements+(ICEs):+what+they+do+and+how+they+work.">Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work.</a> Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).</li><li>Garcill&#225;n-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+bacterial+plasmids+based+on+mobility+and+plasmid+population+biology.">Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).</li><li>Smillie, C., Garcill&#225;n-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+plasmids.">Mobility of plasmids.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).</li><li>Garcill&#225;n-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diversity+of+conjugative+relaxases+and+its+application+in+plasmid+classification.">The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).</li><li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+range+of+IncP-7+conjugative+plasmid+pCAR2+from+Pseudomonas+putida+HS01+is+broader+than+from+other+Pseudomonas+strains.">Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains.</a> Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).</li><li>Yanagida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+the+transferability+of+plasmids+pCAR1,+pB10,+R388,+and+NAH7+among+Pseudomonas+putida+at+different+cell+densities.">Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).</li><li>Schuurmans, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+growth+rate+and+selection+pressure+on+rates+of+transfer+of+an+antibiotic+resistance+plasmid+between+E.+coli+strains.">Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains.</a> Plasmid. 72, 1-8 (2014).</li><li>Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+surface+mating+systems+among+conjugative+drug+resistance+plasmids+in+Escherichia+coli+K-12.">Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12.</a> Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).</li><li>Nakazawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+transferability+of+incompatibility+(Inc)+P-7+plasmid+pCAR1+and+IncP-1+plasmid+pBP136+in+stirring+liquid+conditions.">Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions.</a> PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).</li><li>Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ecological+factors+on+conjugal+transfer+of+chromium-resistant+plasmid+in+Escherichia+coli+isolated+from+tannery+effluent.">Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).</li><li>Sakuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divalent+cations+increase+the+conjugation+efficiency+of+the+incompatibility+P-7+group+plasmid+pCAR1+among+different+Pseudomonas+hosts.">Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts.</a> Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).</li><li>Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-plasmid+transfer+to+and+from+Escherichia+coli+strains+Isolated+from+human+fecal+samples.">R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).</li><li>Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+mating+pair+formation+in+plasmid+population+dynamics.">Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics.</a> Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).</li><li>Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytology+of+bacterial+conjugation.">The cytology of bacterial conjugation.</a> EcoSal Plus. 2004, (2004).</li><li>Minoia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+bistability+in+horizontal+transfer+control+of+a+genomic+island+in+Pseudomonas.">Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).</li><li>Kamachi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+pBP136+from+Bordetella+pertussis+represents+an+ancestral+form+of+IncP-1beta+plasmids+without+accessory+mobile+elements.">Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements.</a> Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).</li><li>Simon, R., Priefer, U., P&#252;hler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad+host+range+mobilization+system+for+in+vivo+genetic+engineering:+transposon+mutagenesis+in+gram+negative+bacteria.">A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria.</a> Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).</li><li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria.">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).</li><li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+replication,+maintenance,+and+transfer+features+of+the+IncP-7+plasmid+pCAR1,+which+carries+genes+involved+in+carbazole+and+dioxin+degradation.">Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).</li><li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analyses+revealed+transfer+ranges+of+IncP-1,+IncP-7,+and+IncP-9+plasmids+in+a+soil+bacterial+community.">Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).</li><li>Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconsideration+of+the+derivation+of+most+probable+numbers,+their+standard+deviations,+confidence+bounds+and+rarity+values.">Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values.</a> Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).</li><li>Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+horizontal+transfer+of+mobile+genetic+elements.">In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements.</a> FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).</li><li>Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+vectors+containing+non-antibiotic+resistance+selection+markers+for+cloning+and+stable+chromosomal+insertion+of+foreign+genes+in+gram-negative+bacteria.">Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).</li><li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range,+high+copy+number,+RSF1010-derived+vectors,+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas.">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li><li>Maeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+nucleotide+sequence+of+carbazole/dioxin-degrading+plasmid+pCAR1+in+Pseudomonas+resinovorans+strain+CA10+indicates+its+mosaicity+and+the+presence+of+large+catabolic+transposon+Tn4676.">Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676.</a> Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).</li><li>Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+nucleotide+sequence+of+pCAR2:+pCAR2+and+pCAR1+were+structurally+identical+IncP-7+carbazole+degradative+plasmids.">The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).</li></ol>

यहाँ, हम transconjugants की संख्या का अनुमान लगाने के लिए एक सीपीसीबी विधि का उपयोग करते हुए विभिन्न स्थितियों के तहत विकार आवृत्ति में मतभेदों का पता लगाने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते है...

बैक्टीरियल विकार के मोबाइल आनुवंशिक तत्वों, conjugative plasmids, और एकीकृत और conjugative तत्वों (ICEs) आनुवंशिक जानकारी के क्षैतिज प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है । यह तेजी से जीवाणु विकास और अनुकूलन को बढ़ावा देने और बहुऔषध प्रतिरोध जीन1,2संचारित कर सकते हैं । विकार आवृत्ति डीएनए (भीड़) और संभोग युग्म गठन (MPF), सेक्स पिली, जो भीड़ और MPF प्रकार3,4के अनुसार वर्गीकृत कर रहे है सहित के लिए conjugative तत्वों पर इनकोडिंग प्रोटीन से प्रभावित किया जा सकता है, 5. यह भी दाता और प्राप्तकर्ता जोड़ी6 और कोशिकाओं की वृद्धि की स्थिति से प्रभावित कर सकते है7,8,9,10,11,12 ( विकास दर, कोशिका घनत्व, ठोस सतह या तरल मध्यम, तापमान, पोषक तत्वों की उपलब्धता, और cations की उपस्थिति) । कैसे बैक्टीरिया के बीच फैले conjugative तत्वों को समझने के लिए, यह विस्तार से विकार आवृत्ति की तुलना करने के लिए आवश्यक है ।
दाता और संभोग के बाद प्राप्तकर्ता जोड़े के बीच विकार आवृत्ति आमतौर पर इस प्रकार के रूप में पारंपरिक तरीकों से अनुमानित हैं । (i) सबसे पहले, दाता और प्राप्तकर्ता की कालोनियों की संख्या गिनी जाती है; (ii) फिर, प्राप्तकर्ता कालोनियों, जो conjugative तत्व प्राप्त (= transconjugants) गिना जाता है; (iii) और अंत में, विकार आवृत्ति की गणना कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) द्वारा transconjugants के दाता और/या13प्राप्तकर्ता के द्वारा की जाती है । हालांकि, जब इस विधि का उपयोग करते हुए, पृष्ठभूमि उच्च है के कारण अतिरिक्त विकार घटनाओं पर भी हो सकता है कि चुनिंदा प्लेटों transconjugants प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जब कोशिका घनत्व उच्च10है । इसलिए, यह आवृत्ति (एक 10-गुना अंतर के नीचे) में छोटे मतभेदों का पता लगाने के लिए मुश्किल है । हम हाल ही में एक सबसे संभावित संख्या (सीपीसीबी) तरल एंटीबायोटिक दवाओं की एक उच्च एकाग्रता युक्त माध्यम का उपयोग कर विधि शुरू की । इस विधि चयनात्मक माध्यम में आगे विकार बाधा द्वारा पृष्ठभूमि कम; इस प्रकार, विकार आवृत्ति उच्च संकल्प के साथ अनुमान लगाया जा सकता है ।
विकार को तीन चरणों में बाँटा जा सकता है: (१) दाता की आसक्ति-प्राप्तकर्ता की जोड़ी (२) conjugative अंतरण की दीक्षा, और (३) पृथक्करण की जोड़ी१४. कदम के दौरान (1) और (3), वहां दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच शारीरिक संपर्क है; इस प्रकार, कोशिका घनत्व और पर्यावरणीय स्थितियाँ इन कदमों को प्रभावित कर सकती हैं, हालाँकि सेक्स पिली की विशेषताएँ भी महत्वपूर्ण हैं. कदम (2) की संभावना कई बाहरी परिवर्तन है, जो प्लाज्मिड, दाता, और प्राप्तकर्ता की विभिंन सुविधाओं से प्रभावित हो सकता है के जवाब में विकार में शामिल जीन की अभिव्यक्ति द्वारा विनियमित है । हालांकि शारीरिक लगाव या दाता-प्राप्तकर्ता जोड़े की टुकड़ी गणितीय रूप से कणों के रूप में कोशिकाओं का एक आकलन का उपयोग कर अनुकरण किया जा सकता है, कदम (2) की आवृत्ति प्रयोग मापा जाना चाहिए । वहां कितनी बार दाताओं विकार शुरू कर सकते है [कदम (2)] प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी15,16का उपयोग कर के प्रत्यक्ष टिप्पणियों पर कुछ रिपोर्टों गया है; बड़ी संख्या में कक्षों की निगरानी की जानी चाहिए, क्योंकि हालांकि, इन विधियों उच्च प्रवाह नहीं हैं । इसलिए, हम प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग करके चरण (2) की आवृत्ति की प्रायिकता का अनुमान लगाने के लिए एक नई विधि विकसित की है । हमारी विधि किसी भी प्लाज्मिड के लिए लागू किया जा सकता है, विकार के लिए आवश्यक जीन की पहचान के बिना ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlow</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8599600</td>
			<td>Sheath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospheres (10 &#956;m)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>beads to set up the FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Yamato Scientific Co. Ltd</td>
			<td>211197-IC802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VIS Spectrophotometer UV-1800</td>
			<td>SIMADZU Corporation</td>
			<td>UV-1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>NIPPON Genetics Co, Ltd</td>
			<td>TR5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate type Petri dish</td>
			<td>AXEL</td>
			<td>1-9668-01</td>
			<td>for validation of sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>membrane filter</td>
			<td>ADVANTEC</td>
			<td>C045A025A</td>
			<td>for filter mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pippettes</td>
			<td>Nichiryo CO. Ltd</td>
			<td>00-NPX2-20, 
			00-NPX2-200, 
			00-NPX2-1000</td>
			<td>0.5-10 &#956;L, 20-200 &#956;L, 100-1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-channel pippetes</td>
			<td>Nichiryo CO. Ltd</td>
			<td>00-NPM-8VP, 
			00-NPM-8LP</td>
			<td>0.5-10 &#956;L, 20-200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01162-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>077-02974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>115-00342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>AXEL</td>
			<td>3-1491-51</td>
			<td>JPND90-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes</td>
			<td>Fukaekasei</td>
			<td>131-815C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL disposable spinner flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution comparison of bacterial conjugation frequencies

बैक्टीरियल विकार एक conjugative डीएनए तत्व के माध्यम से एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के क्षैतिज हस्तांतरण में एक महत्वपूर्ण कदम है । विभिंन स्थितियों के तहत विकार आवृत्ति की गहराई में तुलना समझ में कैसे conjugative तत्व प्रकृति में फैलता है की आवश्यकता है । हालांकि, विकार आवृत्ति की तुलना के लिए पारंपरिक तरीकों में गहराई से तुलना के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि उच्च पृष्ठभूमि के चयनात्मक प्लेट पर अतिरिक्त विकार घटनाओं की घटना की वजह से । हम सफलतापूर्वक एक सबसे संभावित संख्या (सीपीसीबी) विधि शुरू करने और एंटीबायोटिक दवाओं के एक उच्च एकाग्रता के लिए चयनात्मक तरल माध्यम में आगे विकार को रोकने के द्वारा पृष्ठभूमि कम । इसके अलावा, हम कितनी बार दाता कोशिकाओं प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा प्राप्तकर्ता पूल में एकल दाता कोशिकाओं छंटाई द्वारा विकार आरंभ की संभावना का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है । दो plasmids, pBP136 और pCAR1 का प्रयोग, Pseudomonas putida कोशिकाओं में विकार आवृत्ति में अंतर अलग सरगर्मी दरों पर तरल माध्यम में पाया जा सकता है । विकार दीक्षा की आवृत्तियों pCAR1 के लिए की तुलना में pBP136 के लिए उच्च थे । इन नतीजों का इस्तेमाल करके हम इन दोनों plasmids में विकार फीचर्स को बेहतर तरीके से समझ सकते हैं ।

सीपीसीबी विधि द्वारा विकार आवृति की तुलना
हमारी पिछली रिपोर्ट में, हम pBP136 के विकार आवृत्तियों की तुलना में::gfp और pCAR1::gfp तीन गुना पतला पौंड (1/3 पौंड) तरल माध्यम के साथ ?...

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High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

बैक्टीरियल विकार आवृत्तियों की उच्च संकल्प तुलना

विभिंन स्थितियों के तहत विभिंन बैक्टीरियल conjugative डीएनए तत्वों के व्यवहार को समझने के लिए एक उद्देश्य के साथ, हम विकार आवृत्ति में मतभेदों का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, उच्च संकल्प के साथ, अनुमान लगाने के लिए कैसे कुशलतापूर्वक दाता जीवाणु आरंभ विकार ।

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

यह विधि माइक्रोबायोलॉजी क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है कि विभिन्न बैक्टीरिया के बीच कितनी बार प्लाज्मिड डीएनए फैलाया जा सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि पृष्ठभूमि को कम करके, हम उच्च संकल्प के साथ संजीदशन आवृत्ति में छोटे अंतर का पता लगा सकते हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन Kosuke Yanagiya, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा ।सबसे संभावित संख्या से संजीदब आवृत्ति की गणना करने के लिए, एक रात ोंरात प्राप्तकर्ता संस्कृति से एक मिलीलीटर के साथ एक रात ोंरात दाता संस्कृति से एक मिलीलीटर से 30 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए एक मिलीलीटर फिल्टर, के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया । जबकि सह संस्कृति इनक्यूबेटिंग है, क्रमिक रूप से दाता लुरिया शोरबा, या पौंड, प्लस kanamycin, या प्राप्तकर्ता पौंड प्लस gentamycin प्लेटों पर एक दो दिन की संस्कृति के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर पर त्रिपालेट में चढ़ाना के लिए मूल दाता और प्राप्तकर्ता संस्कृतियों को पतला । इनक्यूबेशन के अंत में, चार गुना में 96-अच्छी सेल संस्कृति प्लेट में धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए कानामाइसिन और जेनेमाइसिन युक्त बाँझ पौंड में फिल्टर पर संस्कृति को फिर से खर्च करें।30 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के बाद, मैन्युअल रूप से दाता और प्राप्तकर्ता आगर प्लेटों और कुओं की संख्या जिसमें ट्रांसकोंजुगैंट प्रकाश माइक्रोस्कोपी से बढ़ने पर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों, या सीएफओ की गणना करें। सबसे संभावित संख्या और उसके विचलन की गणना करने के लिए, एमपीएन गणना कार्यक्रम खोलें। प्रयोग का नाम और तारीख, परीक्षण श्रृंखला की संख्या, और स्प्रेडशीट फ़ाइल के कार्यक्रम पत्रक के पंक्ति सात में कमजोर पड़ने की अधिकतम संख्या दर्ज करें।स्वचालित रूप से उत्पादित इनपुट डेटा तालिकाओं में, कमजोर पड़ने वाले कारक डी कॉलम में फॉर्मूला दर्ज करें, मिलीलीटर या जीडब्ल्यू कॉलम में वॉल्यूम में 0.01, और ट्यूब एन कॉलम की संख्या में चार। कुओं की संख्या दर्ज करें जिसमें ट्रांसकोनजगैंट प्रत्येक नमूना कमजोर पड़ने पर बढ़ी और परिणामों को प्राप्त करने के लिए परिणामों की गणना पर क्लिक करें, प्रति मिलीलीटर सबसे संभावित संख्या, और ऊपरी और कम 95% विश्वास सीमा। फिर प्लाज्मिड्स की संवध आवृत्ति की गणना करने के लिए प्रति मिलीलीटर दाता और प्राप्तकर्ता कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की संख्या से ट्रांसकोन्जूगेंट्स की संख्या को विभाजित करें।इस प्रतिनिधि प्रयोग में, दोनों प्लाज्मिड की संयुग्मित आवृत्ति उच्च सरगर्मी दरों पर बढ़ी है, जिसमें पीबीपी 136 से शुरू की गई संस्कृतियों के लिए शून्य और 400 आरपीएम के बीच देखी गई संयुग्मण आवृत्ति में अधिकतम अंतर है: जीएफपी प्लाज्मिड, और शून्य और 200 आरपीएम के बीच संस्कृतियों के लिए जो pCAR1:gfps plasmid में पेश किए गए थे। संभोग की संभावना की तुलना करने के लिए आवश्यक प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के घनत्व का निर्धारण करने के लिए, संभोग परख विभिन्न दाता और प्राप्तकर्ता घनत्व के साथ किया गया। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, pBP136: gbp 136: gfp ट्रांसकोनजुगेंट एक बार 10 से दाता के तीसरे सीएलयू के लिए एक बार 10 और प्राप्तकर्ता के सातवें सीएलयू के लिए पांचवें से एक बार 10 से एक बार युक्त कुओं के १००% में पता चला, और एक बार 10 से दाता के दूसरे सीएलयू के लिए और एक बार 10 से छठे 10 प्राप्तकर्ता के सातवें सीएलयू के लिए , यह दर्शाता है कि सेल घनत्व बहुत अधिक था।संभोग दाता के 10 CFU के साथ परख और प्राप्तकर्ता के पांचवें CFU के लिए छठे या 10 के लिए 10, हालांकि, ट्रांसकोजुगंत सकारात्मक कुओं की संख्या में कमी आई । इस प्रकार, प्राप्तकर्ता के पांचवें सीएलयू के लिए 10 एक दाता सेल के साथ संभोग के लिए आवश्यक होने की भविष्यवाणी की गई थी । दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों के विभिन्न घनत्व पर pCAR1:gfp के साथ संभोग परख इसी तरह के निष्कर्षों का प्रदर्शन किया, हालांकि कुल मिलाकर ट्रांसकोंजुगंत सकारात्मक कुओं का प्रतिशत pBP136: gfp की तुलना में बहुत कम थे ।यह मानते हुए कि दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाएं एक दूसरे को इसी तरह संलग्न कर सकती हैं, pCAR1 दाता के लिए संाधीनता दीक्षा की संभावना pBP136 दाता के लिए उससे कम थी। इन परिणामों के आधार पर, यह अनुमान लगाया गया था कि प्राप्तकर्ता के सातवें सीएलयू के लिए 10 को FACS द्वारा हल किए गए एकल दाता सेल के लिए आवश्यक था। ट्रांसकोन्जूगेंट पॉजिटिव कुओं की संख्या गिनने के बाद, pBP136 के लिए ट्रांसकोनजगेंट पॉजिटिव कुओं का प्रतिशत: जीएफपी को pCAR1 के लिए उससे बड़ा होना तय किया गया था: जीएफपी, इन दो प्लाज्मिड्स के बीच शुरू किए गए दाता की संभावना में 36 गुना से अधिक अंतर का प्रदर्शन किया गया था।प्रक्रिया का प्रयास करते समय, बैक्टीरियल मिश्रण को हमेशा ध्यान से पतला करने के लिए याद रखना महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

बैक्टीरियल संयुग्मन में शामिल स्थानांतरण प्रोटीन के अनुक्रम विशिष्ट विश्लेषण के लिए संयुग्मी संभोग Assays

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

इष्टतम गुणसूत्र स्थान का निर्धारण (ओं) एक डीएनए तत्व के लिए एक उपंयास Transposon-मध्यस्थता दृष्टिकोण का उपयोग कर ई कोलाई में

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

कम्प्लीमेंट रीसेप्टर के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलती पीसीआर 1 लम्बाई पोलीमॉर्फिजिस जीनोटाइपिंग: अल्जाइमर रोग जीन संवेदनशीलता आकलन के लिए एक अभिनव उपकरण

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Drosophila भ्रूण और Tyramide संकेत प्रवर्धन का उपयोग कर ऊतकों में सीटू संकरण में उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

प्रमोटर कब्जा हाय-सी: उच्च संकल्प, जीनोम-व्यापक प्रमोटर बातचीत की रूपरेखा

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

जड़ Microbiome की खोज: मिट्टी, Rhizosphere से बैक्टीरियल समुदाय डेटा निकालने, और जड़ Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

संक्रमित ऊतकों में बैक्टीरियल जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति आधारित विधि

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

चावल की एक लिंग आबादी में पिघल उच्च संकल्प द्वारा उत्परिवर्तनों की पहचान

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

बैक्टीरियल विल्ट रोग के सरल आनुवंशिक विश्लेषण के लिए राल्स्टोनिया सोलनेसेरम के साथ टीका के बाद टमाटर रूट परिवर्तन

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

खमीर विषाक्तता और दमन स्क्रीन का उपयोग कर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान रास्ते की पहचान

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...