Diese neuartige Methodik ermöglicht es uns, dreidimensionale Baugruppen, die aus gewünschten Einzelzellen angepasst wurden, in einer wässrigen Pufferlösung zu konstruieren, die unspezifisches hydrophiles Polymer enthält, indem ein stabiler Zell-Zell-Kontakt hergestellt wird. In diesem Video zeigen wir, wie wir gewünschte Einzelzellen manipulieren und 3D-Zellbaugruppen ohne künstliches Gerüst konstruieren. Hier zeigen wir das experimentelle Verfahren in unserem Medium mit Dextran als Beispiel.
Um zu beginnen, halten Sie NAMRU Maus Brustdrüsen-Epithelzellen mit fünf Milliliter DMEM, die 10%FBS und 1%Penicillin-Streptomycin, in einem 25 Kubikzentimeter Kolben für zwei bis drei Tage. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, verwenden Sie einen Aspirator, um das ergänzte DMEM zu entfernen und drei bis fünf Milliliter PBS hinzuzufügen, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird, um die Zellen zu waschen. Entfernen Sie mit einem Aspirator alle PBS aus dem Kolben.
Fügen Sie 1,5 Milliliter Trypsin hinzu, das bei 37 Grad Celsius vorgewärmt wird. In einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius für mindestens ein bis zwei Minuten inkubieren. Danach 3,5 Milliliter DMEM mit 10%FBS und 1%Penicillin-Streptomycin hinzufügen.
Pipette nach oben und unten zu mischen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie sie bei 417 mal G für drei Minuten bei Raumtemperatur. Dann, aspirieren Sie das Medium.
Fügen Sie fünf Millimeter frisches DMEM mit 10%FBS und 1%Penicillin-Streptomycin hinzu. Und bei Bedarf verwenden Sie eine Kryokonservierungslösung, um die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu kryoservieren. Mischen Sie zuerst 10 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10%FBS und 1%Penicillin-Streptomycin mit 0,8 Gramm Dextran, um eine 80 Milligramm pro Milliliter Dextran-Lösung vorzubereiten.
Mischen Sie 200 Mikroliter dieser Dextran-Lösung mit 200 Mikrolitern der zuvor vorbereiteten Zellsuspension, um eine Zellsuspension mit 40 Milligramm pro Milliliter Dextran-Medium zu erzeugen. Um zu beginnen, schalten Sie Laser, beachten Sie, dass die Verwendung eines Laserstrahls mit einer Wellenlänge im roten bis nahen Infrarotbereich am effektivsten ist. Öffnen Sie als Nächstes die Software, indem Sie auf das Softwaresymbol doppelklicken.
Doppelklicken Sie auf das Symbol für die Kamera und beachten Sie, dass die entsprechende Anzeige angezeigt wird. Dann doppelklicken Sie auf die Symbole für die Licht emittierende Diode, den Fokus anpassen, und die bewegliche Bühne, um ihre Displays als auch zu öffnen. Platzieren Sie zunächst zwei Glasabstandhalter auf der unteren Abdeckung Glasrutsche.
20 Mikroliter, die zuvor vorbereitete Dextran-Ergänzungszellsuspension, auf den unteren Deckelglasschlitten übertragen. Legen Sie dann die obere Abdeckung Glasrutsche auf die Abstandshalter, die die Zellsuspension bedecken. Legen Sie die Probenzelle auf die untere Objektivlinse mit 10 Mikroliter destilliertem Wasser für die Wassertauchmikroskopie.
Befestigen Sie die obere Objektivlinse an der Oberseite der Probenzelle mit 10 Mikroliter destilliertem Wasser. Klicken Sie als Nächstes auf die Ein-Aus-Schaltfläche im Fenster zur Mikroskopbeleuchtung, um die LED einzuschalten. Klicken Sie auf die Richtungsschaltflächen im Objektivpositionierungsfenster, um den Abstand zwischen der Probe und der unteren Objektivlinse anzupassen, bis sie im Fokus steht.
Stellen Sie die Intensität jedes Laserstrahls im Signaldämpfungsfenster auf 1500 Milliwatt ein. Klicken Sie dann auf die beiden Lasersymbole, um die Laserstrahlen an Position eins und Position zwei zu bestrahlen. Klicken Sie auf die Richtungsschaltflächen im Beispielpositionierungsfenster, um die Beispielstufe zu verschieben, bis eine Zelle an Position 1 gefangen ist.
Klicken und ziehen Sie den Cursor, der Position 2 angibt, bis eine andere Zelle an Position 2 gefangen ist. Um zu beginnen, bearbeiten Sie eine einzelne Zelle, sodass sie mit einer anderen Zelle in Kontakt steht. Bewahren Sie diese Bedingung 300 Sekunden lang auf, sodass die Zelle 300 Sekunden lang einem Laser ausgesetzt ist.
Zeichnen Sie die x-y-Achse auf. Fangen Sie eine andere Zelle auf, und transportieren Sie sie zu den ersten beiden Zellen, um eine beliebige 2D-Zellenassembly zu erstellen. Bewegen Sie dann die Bühne nach oben und unten, um eine 3D-Zellbaugruppe zu erstellen.
Vergewissern Sie sich, dass die Baugruppe auch nach dem Ausschalten des Lasers noch stabil ist. In dieser Studie werden lösliche Polymere bei der Konstruktion von 3D-Einzelzellbaugruppen verwendet. Eine Beispielstruktur, die mit der optischen Doppelstrahl-Pinzette gebildet wurde, wird hier gezeigt.
Wenn das Experiment erfolgreich ist, bleiben diese zellulären Baugruppen auch nach dem Ausschalten des Lasers stabil. Diese neue Methode ist für den Bau von 3D-Zellbaugruppen in einem wässrigen Medium mit natürlichem hydrophilem Polymer bestimmt. Es wird mit großer Wahrscheinlichkeit erwartet, mit dem Bau einer solchen Art von Zellbaugruppen der nächsten Generation mit einigen der leistungsstarken Werkzeuge auf dem Gebiet der regenerativen Medizin und Tissue-Engineering zu beginnen.
