Integration af denne metode med dråbebaserede mikrofluidics hjælper med at besvare centrale spørgsmål vedrørende systemimmunologi for at kode cellulær heterogenitet og kommunikation mellem enkelte celler eller patogener. Den største fordel ved denne teknik, som vi udviklede, er, at denne tip belastning procedure giver mulighed for indkapsling af sjældne celler i dråber nøje matcher den forventede procent fordeling. Visuel demonstration af denne metode er afgørende for at forstå, hvordan man bruger pipettespidser til at indlæse celler til kønsbestemte dråber og hente celler fra dråberne.
For tip belastning for vandig dråbe generation, først tilsættes tre milliliter overfladeaktivt stof til to milliliter flourinated olie og trække oliefase blandingen i en 2,5 milliliter sprøjte. Fjern eventuelle luftbobler fra sprøjten, og tilslut sprøjten til et stykke Teflonslange af passende længde. Læg to prøvesprøjter i med en passende bikompatibel mineralsk olie, og tilslut sprøjten til et andet stykke Teflonslange af passende længde.
Dernæst punch en fem millimeter diameter Polydimethylsiloxan eller PDMS stik fra en hærdet EDMS plade, og punch en en millimeter hul gennem midten af stikket. Sæt proppen tæt ind i den øverste ende af en 200 mikroliterpipettespids, og sæt slangen fastgjort til den bikompatible mineraloliesprøjte i stikket. Tryk sprøjtestempelet langsomt ned for at fylde pipettespidsen med mineralsk olie, der skubber al den resterende luft ud.
Læg forsigtigt både prøvesprøjter og den flourinerede oliesprøjt på en sprøjtepumpe. Når al luft er fjernet, sænkes hver pipettespids ned i prøveopløsningen, og der aspirerer ca. 100 mikroliter celleprøve i spidserne. Dernæst indsættes begge de prøveholdige pipettespidser i de to indvendige indløb i PDMS-spånen, og sæt det rør, der indeholder oliefaseblandingen, ind i det ydre indløb.
Indstil strømningshastighederne på sprøjtepumpen som angivet Og ind og ind og angiv dimensionerne for hver sprøjte. Start pumpen for at skylle prøveopløsningen gennem enhedens indre kanaler og oliefasen gennem enhedens ydre kanal. Sæt derefter et stykke slange af en passende længde i stikkontakten for at begynde at indsamle dråberne, når dråbeformationen er stabil, og opsaml dråberne i et låserør.
Når alle dråberne er indsamlet, tilsættes 200 mikroliter RPMI-medium, uden serum, oven på dråberne, og prøven inkuberes med hullet på låget af låserøret i den relevante forsøgsperiode. Til emulsionssplænge tilsættes først to milliliter PFO til otte milliliter flouineret olie, og brug en sprøjte til at fjerne den overskydende olie fra bunden af dråbeopsamlingsrøret. Derefter tilsættes 100 mikroliter af 20% PFO-opløsning til emulsionen for at frigive de indkapslede celler ind i den vandige fase, og bank kortvarigt på røret for at blande.
Glem ikke, at PFO kan være skadeligt for cellerne. Og derfor skal du holde kontakten med PFO på et minimum. Efter et til to minutter drejes opløsningen ved den lavest mulige relative centrifugalkraft i 30 sekunder, og 550 mikroliter af den vandige fraktion overføres straks til et nyt aflåst rør indeholdende 500 mikroliter kold PBS suppleret med 2% Føtal Kalveserum eller FCS.
Lad eventuel resterende olie synke til bunden af det nye låserør og forsigtigt overføre 950 mikroliter af cellen, der indeholder vandig fase, til et nyt låserør. Sørg for, at olien ikke overføres sammen med den vandige fase ind i det nye låserør. Derefter indsamles cellerne ved centrifugering og re-suspendere pellet i 300 mikroliter af frisk kold PBS suppleret med 2% FCS.
Ved hjælp af tip belastning tilgang som netop påvist, Jurkat T celle indkapsling satser sammenfaldende med de statistisk forudsagte værdier kan opnås. Bemærkelsesværdigt, selv med tilholdst celler som tumorceller, som har tendens til at klumpe, eller sjældne celler såsom plasmacytoid dendritiske celler, en forbedret indkapsling effektivitet er observeret. Under denne repræsentative indkapsling regenererede dråberne ved hjælp af ultralav geleringstemperatur agarose og geléagtig efter produktion for at danne agarosehydrgelperler, der tillod efterfølgende downstream-analyse via mikroskopi og flowcytometri.
Mikroskopisk analyse viste, at celleparring blev opnået ved forskellige kombinationer vejledende høj gennemløb celle parring og analyse af den samme population af hydrogel perler ved flow cytometri, viste, at perler uden celler kunne adskilles fra perlerne med celler baseret på deres særskilte fremad og sidegående scatter mønstre. Faktisk gating på populationen af perler uden celler bekræftet en mangel på celle indkapsling ved fraværet af fluorescerende signaler, mens gating på perle population med celler afslørede eksistensen af flere sub-populationer, der tyder på indkapsling af forskelligt mærket Jurkat T celler. Mens du arbejder med denne metode, er det vigtigt at huske, at cellekoncentration er en begrænsende faktor, og skal optimeres til at sikre effektiv celleindkapsling og celle parring.
Efter denne procedure kan en eller to celler ikke blot indkapsles i dråber med høj effektivitet, men flere celler eller celletyper kan indkapsles for en mere nøjagtig replikering af cellulære mikromiljø. Denne teknik vil bane vejen for forskere inden for immunologi og relaterede discipliner for optimal udnyttelse af arcellepopulationer og deres effektive indkapsling i dråber, for at studere cellulære adfærd i et støjfrit miljø.
