बूंद आधारित माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ इस पद्धति को एकीकृत करने से सिस्टम इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र से संबंधित प्रमुख सवालों का जवाब देने में मदद मिलती है ताकि एकल कोशिकाओं या रोगजनकों के बीच सेलुलर विषमता और संचार को कोड किया जा सके। इस तकनीक का मुख्य लाभ जो हमने विकसित किया है, कि यह टिप लोडिंग प्रक्रिया बूंदों में दुर्लभ कोशिकाओं के एनकैप्सुलेशन को भविष्यवाणी किए गए प्रतिशत वितरण से निकटता से मेल खाती है। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को लिंग की बूंदों में लोड करने और बूंदों से कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करने के लिए पिपेट टिप्स का उपयोग कैसे किया जाए।
जलीय बूंद पीढ़ी के लिए टिप लोडिंग के लिए, पहले दो मिलीलीटर आटे के तेल में सर्फेक्टेंट के तीन मिलीलीटर जोड़ें और तेल चरण मिश्रण को 2.5 मिलीलीटर सिरिंज में खींचें। सिरिंज से किसी भी हवा के बुलबुले निकालें और एक उचित लंबाई के टेफ्लॉन ट्यूबिंग के एक टुकड़े से सिरिंज कनेक्ट करें। एक उपयुक्त द्वि-संगत खनिज तेल के साथ दो नमूना सिरिंज लोड करें, और सिरिंज को उचित लंबाई के टेफ्लॉन ट्यूबिंग के दूसरे टुकड़े से जोड़ें।
इसके बाद, एक ठीक ईडीएमएस स्लैब से पांच मिलीमीटर व्यास पॉलीडिमेथाइलसिलोक्सेन या पीडीएमएस प्लग पंच करें, और प्लग के केंद्र के माध्यम से एक मिलीमीटर छेद पंच करें। प्लग को कसकर 200 माइक्रोलिटर पिपेट-टिप के शीर्ष अंत में डालें और प्लग में द्वि-संगत खनिज तेल सिरिंज से जुड़े ट्यूबिंग डालें। सभी अवशिष्ट हवा को बाहर धकेलने वाले खनिज तेल के साथ पिपेट-टिप को भरने के लिए सिरिंज प्लंजर को धीरे-धीरे दबाना।
ध्यान से दोनों नमूना सिरिंज और flourinated तेल सिरिंज, एक सिरिंज पंप पर जगह है। जब हवा के सभी हटा दिया गया है, नमूना समाधान में प्रत्येक पिपेट टिप कम और सुझावों में सेल नमूना के बारे में १०० माइक्रोलीटर aspirate । इसके बाद, पीडीएमएस चिप के दो आंतरिक इनलेट्स में नमूना युक्त पिपेट-टिप्स दोनों डालें और बाहरी प्रवेश में तेल चरण मिश्रण युक्त ट्यूब डालें।
संकेत के रूप में सिरिंज पंप पर प्रवाह दरों को निर्धारित करें और प्रत्येक सिरिंज के आयामों को दर्ज करें और सेट करें। डिवाइस के भीतरी चैनलों के माध्यम से नमूना समाधान फ्लश करने के लिए पंप शुरू करें, और डिवाइस के बाहरी चैनल के माध्यम से तेल चरण। फिर बूंदों के गठन स्थिर होने पर बूंदों को इकट्ठा करने के लिए, एक लॉक ट्यूब में बूंदों को इकट्ठा करने के लिए आउटलेट में उचित लंबाई के ट्यूबिंग का एक टुकड़ा प्लग करें।
जब सभी बूंदों को एकत्र किया गया है, तो बूंदों के शीर्ष पर, सीरम के बिना आरपीएमआई माध्यम के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और उचित प्रायोगिक समय अवधि के लिए लॉक ट्यूब के ढक्कन पर छेद के साथ नमूना को इनक्यूबेट करें। पायस तोड़ने के लिए, पहले आठ मिलीलीटर फ्लूइनेटेड तेल में पीएफओ के दो मिलीलीटर जोड़ें और बूंद संग्रह ट्यूब के नीचे से अतिरिक्त तेल को हटाने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें। फिर जलीय चरण में एनक्लोजेटेड कोशिकाओं को छोड़ने के लिए पायस में 20% पीएफओ समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए ट्यूब को संक्षेप में टैप करें।
यह न भूलें कि पीएफओ कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकता है। और इसलिए, पीएफओ के साथ संपर्क को कम से कम रखें। एक से दो मिनट के बाद, 30 सेकंड के लिए सबसे कम संभव रिश्तेदार अपकेंद्रित्र बल पर समाधान स्पिन और तुरंत एक नई बंद ट्यूब में जलीय अंश के ५५० माइक्रोलीटर हस्तांतरण ठंड PBS के ५०० माइक्रोलीटर युक्त, 2% भ्रूण बछड़ा सीरम, या FCS के साथ पूरक ।
किसी भी अवशिष्ट तेल को नए लॉक ट्यूब के नीचे सिंक करने दें और ध्यान से एक नए लॉक ट्यूब में जलीय चरण युक्त कोशिका के 950 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि तेल को जलीय चरण के साथ नए लॉक ट्यूब में स्थानांतरित नहीं किया गया है। फिर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 2% एफसीएस के साथ पूरक ताजा ठंडे पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
टिप लोडिंग दृष्टिकोण का उपयोग करना जैसा कि अभी प्रदर्शित किया गया है, जुरकैट टी सेल एनकैप्सुलेशन दर सांख्यिकीय भविष्यवाणी मूल्यों के साथ संयोग से प्राप्त की जा सकती है। उल्लेखनीय रूप से, यहां तक कि ट्यूमर कोशिकाओं जैसी अनुयायी कोशिकाओं के साथ, जो झुरमुट, या प्लाज्मासाइटोइड डेंड्रिटिक कोशिकाओं जैसी दुर्लभ कोशिकाओं के साथ, एक बेहतर एनकैप्सुलेशन दक्षता देखी जाती है। इस प्रतिनिधि एनकैप्सुलेशन के दौरान, अल्ट्रा-लो जेलिंग तापमान का उपयोग करके पुनर्जीवित की गई बूंदें एगर उठे हाइड्रोगेल मोतियों के रूप में उत्पादन के बाद पुनर्जीवित हुईं, जिन्होंने माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से बाद के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की अनुमति दी।
सूक्ष्म विश्लेषण से पता चला है कि सेल पेयरिंग को विभिन्न संयोजनों पर प्राप्त किया गया था, जो फ्लो साइटोमेट्री द्वारा हाइड्रोजेल मोतियों की एक ही आबादी के उच्च थ्रूपुट सेल पेयरिंग और विश्लेषण का संकेत देते हैं, पता चला कि कोशिकाओं के बिना मोतियों को उनके अलग आगे और साइडवर्ड स्कैटर पैटर्न के आधार पर कोशिकाओं के साथ मोतियों से अलग किया जा सकता है। दरअसल, कोशिकाओं के बिना मोतियों की आबादी पर गेटिंग ने फ्लोरोसेंट संकेतों की अनुपस्थिति से कोशिका एनकैप्सुलेशन की कमी की पुष्टि की, जबकि कोशिकाओं के साथ मनका आबादी पर गेटिंग करने से कई उप-आबादी के अस्तित्व का पता चला जो अलग-अलग लेबल वाले जुराका टी कोशिकाओं के एनकैप्सुलेशन का संकेत देता है। इस विधि के साथ काम करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि सेल एकाग्रता एक सीमित कारक है, और कुशल सेल एनकैप्सुलेशन और सेल पेयरिंग का बीमा करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
इस प्रक्रिया के बाद, न केवल एक या दो कोशिकाओं को उच्च दक्षता के साथ बूंदों में समझाया जा सकता है, बल्कि कई कोशिकाओं, या कोशिका प्रकारों को सेलुलर सूक्ष्म पर्यावरण की अधिक सटीक प्रतिकृति के लिए समझाया जा सकता है। यह तकनीक एक शोर मुक्त वातावरण में सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, निशान सेल आबादी के इष्टतम उपयोग और बूंदों में उनके कुशल encapsulation के लिए इम्यूनोलॉजी और संबंधित विषयों के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त करेगी।