이 방법론을 물방울 기반 미세 유체학과 통합하면 단일 세포 또는 병원체 간의 세포 이질성 및 통신을 코딩하기 위해 시스템 면역학 분야와 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 우리가 개발 한이 기술의 주요 장점은,이 팁 로딩 절차는 밀접하게 예측 된 퍼센트 분포와 일치하는 방울에 희귀 세포의 캡슐화를 할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 파이펫 팁을 사용하여 세포를 성별 된 물방울에 로드하고 물방울에서 셀을 검색하는 방법을 이해하기 위해 중요합니다.
수성 액적 생성을 위한 팁 로딩의 경우 먼저 3밀리리터의 계면활성제를 밀가루 오일 2밀리리터에 넣고 오일 상 혼합물을 2.5 밀리리터 주사기로 그립니다. 주사기에서 기포를 제거하고 주사기를 적절한 길이의 테플론 튜브 조각에 연결합니다. 적절한 양립할 수 있는 미네랄 오일로 두 개의 샘플 주사기를 적재하고 주사기를 적절한 길이의 테플론 튜브의 두 번째 조각에 연결합니다.
다음으로, 경화 EDMS 슬래브에서 직경 5밀리미터 직경 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 플러그를 펀치하고 플러그의 중심을 통해 1밀리미터 구멍을 펀치. 플러그를 200 마이크로리터 파이펫 팁의 상단 끝에 단단히 삽입하고 양호환 미네랄 오일 주사기에 부착된 튜브를 플러그에 삽입합니다. 주사기 플런저를 천천히 누르고 파이펫 팁을 미네랄 오일로 채우면 잔류 공기를 모두 밀어내게 됩니다.
시료 주사기와 밀가루 오일 주사기를 주사기 펌프에 조심스럽게 배치합니다. 모든 공기가 제거되면 각 파이펫 팁을 샘플 용액으로 낮추고 약 100 마이크로리터의 셀 샘플을 팁에 흡인시합니다. 다음으로, PDMS 칩의 두 개의 내부 입구에 시료 함유 파이펫 팁을 모두 삽입하고 오일 상 혼합물을 함유한 튜브를 외부 입구에 삽입한다.
지시된 대로 주사기 펌프의 유량을 설정하고 각 주사기의 치수를 입력하고 설정합니다. 펌프를 시작하여 장치의 내부 채널을 통해 시료 솔루션을 플러시하고 장치의 외부 채널을 통해 오일 위상을 낸다. 그런 다음 적절한 길이의 튜브 조각을 콘센트에 연결하여 액적 형성이 안정되면 물방울을 수집하기 시작하여 잠금 튜브의 물방울을 수집합니다.
모든 액적이 수집되면, 적절한 실험 기간 동안 슬럼없이 RPMI 배지 200 마이크로 리터를 추가하고, 물방울 위에 샘플을 배양한다. 에멀젼 파손의 경우 먼저 PFO 2밀리리터를 8밀리리터에 넣고 주사기를 사용하여 물방울 수집 튜브 의 바닥에서 과도한 오일을 제거합니다. 그런 다음 에멀젼에 20%PFO 용액의 100마이크로리터를 추가하여 캡슐화된 세포를 수성 상으로 방출하고 튜브를 짧게 탭하여 혼합합니다.
PFO가 세포에 해로울 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 따라서 PFO와의 접촉을 최소한으로 유지하십시오. 1~2분 후, 가능한 가장 낮은 상대 원심력으로 30초 간 용액을 회전시키고 수성 분수 550마이크로리터를 차가운 PBS 500 마이크로리터가 들어있는 새로운 잠긴 튜브로 즉시 전송하여 2%의 태아 종아리 혈청 또는 FCS로 보완합니다.
잔류 오일이 새로운 잠금 튜브의 바닥으로 가라앉게 하고 수성 상이 포함된 세포의 950 마이크로리터를 새로운 잠금 튜브로 조심스럽게 이송하십시오. 수중 상과 함께 오일이 새로운 잠금 튜브로 전달되지 않았는지 확인하십시오. 그런 다음 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 2 %FCS로 보충 신선한 감기 PBS의 300 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
팁 로딩 접근법을 방금 입증한 바와 같이, 통계적으로 예측된 값과 일치하는 Jurkat T 셀 캡슐화 속도를 얻을 수 있다. 놀랍게도, 종양 세포와 같은 부착 세포, 덩어리 경향이 있는 종양 세포, 또는 혈장 세포 수지상 세포와 같은 희소한 세포에도, 향상된 캡슐화 효율이 관찰됩니다. 이 대표적인 캡슐화 동안, 액적은 극저겔링 온도 아가로즈를 사용하여 재생되고 제조 후 겔화되어 현미경 검사법과 유동 세포측정을 통해 후속 다운스트림 분석을 허용하는 아가로즈 하이드로겔 구슬을 형성한다.
현미경 분석에 따르면 세포 페어링은 유동 세포측정에 의한 하이드로겔 구슬의 동일한 집단의 높은 처리량 세포 페어링 및 분석을 나타내는 상이한 조합에서 달성되었으며, 세포가 없는 구슬은 서로 다른 전방 및 측면 산란 패턴을 기반으로 세포와 구슬과 분리될 수 있음을 밝혔다. 실제로, 세포 없이 구슬의 인구에 게이팅세포와 비드 인구에 게이팅하는 동안 형광 신호의 부재에 의해 세포 캡슐화의 부족을 확인 다른 표지 Jurkat T 세포의 캡슐화를 나타내는 다중 하위 집단의 존재를 밝혔다. 이 방법을 사용하는 동안 세포 농도가 제한 요소이며 효율적인 세포 캡슐화 및 세포 페어링을 보장하기 위해 최적화되어야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 하나 또는 두 개의 세포가 고효율을 가진 물방울에 캡슐화 될 수 있을 뿐만 아니라, 다중 세포, 또는 세포 모형은 세포 마이크로 환경의 보다 정확한 복제를 위해 캡슐화될 수 있다. 이 기술은 무소음 환경에서 세포 행동을 연구하기 위해 흉터 세포 인구의 최적 활용과 물방울의 효율적인 캡슐화를 위해 면역학 및 관련 분야의 연구자들이 길을 열어줄 것입니다.
