Name: proofreading and dna repair assay using single nucleotide extension and maldi-tof mass spectrometry analysis
Uploaded: 2018-06-19T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Vi tackar de NCFPB integrerade Core Facility för funktionell genomik (Taipei, Taiwan) och NRPB farmakogenomik Lab (Taipei, Taiwan) för deras tekniska support. Detta arbete stöds av forskningsanslag från stiftelsen Taiwan hälsa (L-I.L.) och ministeriet för vetenskap och teknik, Taipei, Taiwan, ROC [mest 105-2320-B-002-047] för Wei-Yao Hu, [mest 105-2628-B-002-051-MY3] för Kang-Yi Su och [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] för Liang-i Lin.

1. primer/mall förberedelse
<ol><li>Utforma primers/mallar med en balanserad G + C innehåll mellan 40% och 60% som en sekvensering eller PCR primer design. Använda primers 18 till 21 nt för en lämplig glödgning och bättre MS signaler.</li>
	<li>Utforma mallen genom att ställa in 50 ° C som den lägsta smälttemperaturen för regionen duplex med minst 7 nt av 5'-överhäng att separera signalerna mellan grundfärgens och mallen. Obs: till exempel för substratet P21/T28 i tabell 1, 21-nt pri...

<ol>
	<li>Loeb, L. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+of+DNA+synthesis.">Fidelity of DNA synthesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).</li><li>Kornberg, A., Baker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA replication. , (1992).</li><li>Carroll, S. S., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+aspects+of+DNA+polymerases:+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+(Klenow+fragment)+as+a+paradigm.">Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm.</a> Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).</li><li>Echols, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+Mechanisms+in+DNA+Replication.">Fidelity Mechanisms in DNA Replication.</a> Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+and+chemical+mechanism+of+high-fidelity+DNA+polymerases.">The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).</li><li>Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerase+proofreading:+Multiple+roles+maintain+genome+stability.">DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).</li><li>Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerase+proofreading:+active+site+switching+catalyzed+by+the+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).</li><li>Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+neighboring+bases+on+DNA+polymerase+insertion+and+proofreading+fidelity.">Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).</li><li>Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+mispair+extension+kinetics.+Comparison+of+DNA+polymerase+&#945;+and+reverse+transcriptase.">Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase &#945; and reverse transcriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).</li><li>Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+screening+technique+for+DNA+polymerases+that+can+incorporate+modified+nucleotides.+Pseudothymidine+as+a+substrate+for+thermostable+polymerases.">An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases.</a> Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).</li><li>Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+2-aminopurine+fluorescence+to+measure+incorporation+of+incorrect+nucleotides+by+wild+type+and+mutant+bacteriophage+T4+DNA+polymerases.">Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).</li><li>Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+analog+2-aminopurine+as+a+spectroscopic+probe+of+nucleotide+incorporation+by+the+Klenow+fragment+of+Escherichia+coli+polymerase+I+and+bacteriophage+T4+DNA+polymerase.">The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).</li><li>Leung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+G-quadruplex-based+luminescent+switch-on+probe+for+the+detection+of+polymerase+3'-5'+proofreading+activity.">A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity.</a> Methods. 64 (3), 224-228 (2013).</li><li>Song, C., Zhang, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+DNA+polymerase+fidelity+by+singly+labeled+smart+fluorescent+probes.">Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes.</a> Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).</li><li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).</li><li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genotyping+of+PCR+products+with+MassTag-labeled+primers.">Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers.</a> Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+MALDI-TOF+based+methodology+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms.">A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).</li><li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+(EGFR)+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer.">Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li><li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+V-mediated+deoxyinosine+excision+repair+in+vitro.">Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro.</a> DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).</li><li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+excision+of+3'+penultimate+errors+by+DNA+polymerase+I+and+its+role+in+endonuclease+V-mediated+DNA+repair.">The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair.</a> DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).</li><li>Kucera, R. B., Nichols, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Dependent+DNA+Polymerases.">DNA-Dependent DNA Polymerases.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Weiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+deoxyinosine+from+the+Escherichia+coli+chromosome+as+studied+by+oligonucleotide+transformation.">Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation.</a> DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).</li><li>Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endonuclease+V:+an+unusual+enzyme+for+repair+of+DNA+deamination.">Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).</li><li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+proofreading+and+DNA+repair+assay.">Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay.</a> DNA Repair. 61, 63-75 (2018).</li><li>Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proofreading+DNA:+recognition+of+aberrant+DNA+termini+by+the+Klenow+fragment+of+DNA+polymerase+I.">Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).</li><li>Santa Lucia, J., Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs.">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).</li><li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerase+I+proofreading+exonuclease+activity+is+required+for+endonuclease+V+repair+pathway+both+in+vitro+and+in+vivo.">DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo.</a> DNA Repair. 64, 59-67 (2018).</li></ol>

Denna studie beskrivs en steg för steg korrekturläsning aktivitet assay analyseras av valda kommersiella instrumentet (se Tabell för material) med MALDI-TOF MS. De stora fördelarna inkluderar att primer och mallen är etikett gratis och enkelt att utföra, vilket möjliggör större flexibilitet i utformningen av experiment. En ström-lime komplett bearbetning av 30 korrekturläsning tester skulle ta 4 h, inklusive 3 h för att manuellt utföra korrekturläsning reaktionerna och deras rensning, medan...

DNA-polymerases under DNA-replikation korrekturläsning funktioner är avgörande för hög trohet av genetisk information som behöver överföras till avkomman1,2,3,4, 5,6,7. Att kunna bedöma bidragen av polymeras korrekturläsning exonucleases skulle klargöra mekanismerna skydda genetiska stabilitet.
Radioisotop märkning och gel-baserade analyser i kombination med Densitometrisk analyser av autoradiograms eller fosfor imaging8,9,10 har traditionellt använts för att upptäcka korrekturläsning aktivitet av DNA polymeraser. Medan funktionell, finns dessa analyser mödosamma, dyra och inte mottaglig för hög genomströmning format. Dessutom lider radioisotoper säkerhetsfrågor inklusive bortskaffande av avfall. Alternativt, korrekturläsning aktiviteter har analyserats av fluorometric tekniker. 2-aminopurine (2-AP) kan exempelvis ingå i tillägget produkter under in vitro- polymeras korrekturläsning analyser för att producera en fluorescerande signal11,12. Tyvärr lider dessa synsätt en låg specificitet, eftersom 2-AP kan parkoppla med både tymin och cytosin. Nyare metoder innehålla en känslig G-quadruplex-baserade självlysande påsättning sond för ett polymeras 3' - 5' exonuclease assay13 samt en ensamma-märkt fluorescerande sond för ett polymeras korrekturläsning analys som övervinner några av de ovan nämnda nackdelarna14. Entusiasm för dessa fluorometric metoder minskas på grund av behovet av särskilda märkning av DNA substrat.
Däremot en MALDI-TOF MS för DNA-analys har varit anställd i PinPoint-analysen, där primer filändelsen reaktionerna med omärkt 4 ddNTPs kan användas för att identifiera polymorfismer vid en viss locus15,16,17 och allmänt har antagits i kliniska tillämpningar för mutation upptäckter och cancer diagnoser18. Med dessa grundläggande principer, har vi skapat en etikett-gratis test för in vitro- bestämning av DNA-polymeras korrekturläsning aktivitet som utnyttjar hög upplösning, hög specificitet och hög genomströmning potential av MALDI-TOF MS. med E. coli DNA-polymeras som jag Klenow fragmentet som en modell enzym, dideoxyribonucleotide trifosfater (ddNTPs) som substrat kan ta en ”ögonblicksbild” av korrekturläsning produkter efter en enda nukleotid förlängning via MALDI-TOF MS (bild 1).
Likaså utvecklades denna metod också för en DNA reparation analys där primers innehållande 3' näst sista dI lesioner utsätts för en pol jag reparera assay som härmar endo V nicked reparation intermediärer. Medan inte helt klarlagda, är endo V reparation stigen bara reparera systemet känt att anställa pol jag korrekturläsning exonuclease aktivitet för lesionen excision19,20. Använda MALDI-TOF MS, vi visar en klart definierad lagningslapp där dI kan vara censurerade av pol I när som förekommer i de sista 2 nt av primer innan du lägger den rätta kompletteras nukleotid.
För att studera korrekturläsning och DNA-reparation, denna metod är snabbare och mindre arbetskrävande än tidigare metoder och ger ytterligare information mot mekanism och funktion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1124px;" width="1125">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:331px;">Oligonucleotides</td>
			<td style="width:283px;">Mission Biotech (Taiwan)&#160;</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">phosphorothioate modified oligonucleotides</td>
			<td>&#160;Integrated DNA Technologies (Taiwan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Klenow fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NEBuffer 2.1 (10X)</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>B7202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2&#39;, 3&#39; ddATP</td>
			<td>Trilink Biotechnologies, CA</td>
			<td>N4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2&#39;, 3&#39; ddGTP</td>
			<td>Trilink Biotechnologies, CA</td>
			<td>N4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2&#39;, 3&#39; ddTTP</td>
			<td>Trilink Biotechnologies, CA</td>
			<td>N4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2&#39;, 3&#39; ddCTP</td>
			<td>Trilink Biotechnologies, CA</td>
			<td>N4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dATP, dGTP, dCTP, dTTP set</td>
			<td>Clubio, Taiwan</td>
			<td>CB-R0315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SpectroCHIP array</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#01509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MassARRAY&#160;</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Typer 4.0 software</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#10145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Clean Resin Tool Kit&#160;</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#08040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proofreading and dna repair assay using single nucleotide extension and maldi-tof mass spectrometry analysis

Underhåll av genomet och dess trogna replikering är avgörande för att bevara genetisk information. För att bedöma HiFi replikering, vi har utvecklat en enkel icke-märkt och icke-radio-isotopiska metoden använder en matris-assisted laser desorption jonisering med time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) analys för en korrekturläsning studie. Här, en DNA-polymerase [t.ex. Klenow fragmentet (KF) av Escherichia coli DNA-polymerase jag (pol jag) i denna studie] i närvaro av alla fyra dideoxyribonucleotide-trifosfater används för att bearbeta en omaka primer-mall duplex. Felmatchade primern är sedan korrekturläsa och utökade och utsätts för MALDI-TOF MS. Produkterna kännetecknas av massa ändringen av primern ner till enda nukleotid variationer. Ännu viktigare, kan en korrekturläsning också bestämmas för interna enda missmatchningar, om än vid olika effektivitetsvinster. Missmatchningar ligger på 2-4-nukleotider (nt) från 3' slutet var effektivt korrekturläsa av pol jag, och en obalans på 5 nt från primer slutstationen visade endast en delvis korrigering. Ingen korrekturläsning uppstod för interna oförenligheter ligger på 6-9 nt från primer 3' slutet. Denna metod kan också tillämpas på DNA reparation analyser (t.ex. bedömningen av en base-lesion reparation av substrat för endo V reparation vägen). Primers som innehåller 3' näst sista deoxyinosine (dI) lesioner kan rättas av pol jag. Ja, näst sista T-I, G-I, och A-jag substrat hade sin sista 2 dI-innehållande nukleotider censurerade av pol jag innan du lägger till en rätt ddN 5'-monofosfat (ddNMP) medan näst sista C-jag missmatchningar tolererades av pol I, så att primern förlängas utan reparation, visar känslighet och upplösning av MS test för att mäta DNA-reparation.

Mallar och grundfärger:
Använda proceduren presenteras här, lika molar syntetiska oligonukleotiden mallar och primers av relevanta sekvenser från kommersiella källor kontrollerades för sin renhet och kvalitet (figur 3A; Obs signalerna matchade utsedda massan och den låg bakgrunden) samt för förhållandet mellan maximal intensitet och analyt massan (figu...

Watch this Scientific Journal Video about Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturläsning och DNA reparation Assay använder Single Nucleotide förlängning och MALDI-TOF-masspektrometri.

En icke-märkt, icke-radio-isotopiska metod för DNA-polymeras korrekturläsning och en DNA reparation analys utvecklades med hjälp av högupplösta MALDI-TOF masspektrometri och en enda nukleotid förlängning strategi. Analysen visade sig vara mycket specifika, enkel, snabb och lätt att utföra för korrekturläsning och reparera patchar kortare än 9-nukleotider.

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biochemistry

Cell Biology

Molecular Biology

Unit 1

DNA Replication

DNA Replication and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation för Kvantitativ masspektrometri Analys

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestämning av proteashämmare specificitet i mus vävnad extrakt av MALDI-TOF-masspektrometri: manipulera PH för att orsaka specificitet förändringar

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Med öppen källkod MALDI TOF-MS IDBac pipeline för analys av mikrobiellt protein och specialiserade Metabolitdata

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Dubbla DNA-linjaler för att studera mekanismen för ribosom Translocation med Ennukleotid upplösning

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integrerad Raman spektroskopi och masspektrometri plattform för att studera Single-cell drog upptag, metabolism, och effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...