Name: probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo at JoVE.com

이 작품은 FRM Equipe 그랜트 FRM DEQ20130326509, 직원 회 드 라 검색 ANR 블랑 그랜트, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (P.-플로리다)에 의해 지원 되었다. 우리는 프랑스 국립 연구 기관 (ANR-10-INBS-04-01, «미래에 대 한 투자»)에서 지 원하는 프랑스 BioImaging 인프라를 인정 합니다. 우리 기술 지원에 대 한 PICSL-FBI 인프라에서 브라이스 Detailleur와 클로드 모레티 감사합니다.

1. 설정-최대 빛 시트 현미경
<ol><li>이전 발행물25에서 설정의 설명을 참조 하십시오. 참고: 설치는 똑바로 현미경 단계 및 수평 평면에 밝은 시트 생산 가벼운 시트 모듈의 구성 됩니다. 여기 렌즈 X 10 유리 베트 (그림 4)에 빛 시트를 지시합니다. 탐지 목표 렌즈는 높은 NA (1.1), 필요한 효율적인 tweezing (아래 참조)에 대 한 있습니다.</li>
</ol><p class="jove_title"...

<ol>
	<li>Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+generation,+transmission,+and+integration+during+cell+and+tissue+morphogenesis.">Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).</li><li>Heisenberg, C. -. P., Bella&#239;che, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning.">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li><li>Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+forces+and+stresses+in+situ+in+living+tissues.">Measuring forces and stresses in situ in living tissues.</a> Development. 143 (2), 186-196 (2016).</li><li>Camp&#224;s, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+to+explore+the+mechanics+of+living+embryonic+tissues.">A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 55, 119-130 (2016).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).</li><li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li><li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis.">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).</li><li>Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+embryonic+tissue+mechanics+with+laser+hole+drilling.">Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling.</a> Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+for+morphogenesis+investigated+with+laser+microsurgery+and+quantitative+modeling.">Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling.</a> Science. 300 (5616), 145-149 (2003).</li><li>Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bella&#239;che, Y., Graner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+state,+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue.">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li><li>Etournay, R., Popovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Rauzi, M., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis.">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).</li><li>Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Physical+Properties+of+the+Cell+Cortex.">Determining Physical Properties of the Cell Cortex.</a> Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).</li><li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos.">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li><li>Mitrossilis, D., R&#246;per, J. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransductive+cascade+of+Myo-II-dependent+mesoderm+and+endoderm+invaginations+in+embryo+gastrulation.">Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation.</a> Nature Communications. 8, 13883 (2017).</li><li>Camp&#224;s, O., Mammoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).</li><li>Serwane, F., Mongera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+spatially+varying+mechanical+properties+in+developing+tissues.">In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues.</a> Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).</li><li>Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress+inference+for+two+dimensional+cell+arrays.">Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays.</a> PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).</li><li>Ishihara, S., Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+inference+of+force+dynamics+during+morphogenesis.">Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis.</a> Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).</li><li>Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellFIT:+a+cellular+force-inference+toolkit+using+curvilinear+cell+boundaries.">CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+optical+forces.">Biological applications of optical forces.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Bambardekar, K., Cl&#233;ment, R., Blanc, O., Chard&#232;s, C., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+laser+manipulation+reveals+the+mechanics+of+cell+contacts+in+vivo.">Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).</li><li>Cl&#233;ment, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+Dissipation+Stabilizes+Cell+Shape+Changes+during+Tissue+Morphogenesis.">Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis.</a> Current biology: CB. 27 (20), (2017).</li><li>Chard&#232;s, C., M&#233;n&#233;lec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting-up+a+simple+light+sheet+microscope+for+in+toto+imaging+of+C.+elegans+development.">Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development.</a> Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).</li><li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes.">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li><li>Cavey, M., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cellular+and+Molecular+Dynamics+in+Live+Embryos+Using+Fluorescent+Proteins.">Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins.</a> Drosophila. 420, 219-238 (2008).</li></ol>

광학 족집게는 비-침략 적 방식으로 직접 개발 배아 상피에에서 절대 기계 측정을 수행 하실 수 있습니다. 그런 의미에서 그것은 침략 적 되 고 상대 측정, 주사를 요구 하는 자기 세력을 제공 또는 강한 가정에 의존 하는 유추를 강제로 제공 하 고 또한 상대 레이저 절제 등 다른 방법을 통해 장점을 제공합니다 측량입니다.
프로토콜은 몇 가지 중요 한 단계를 포함합니다. 첫?...

배아 개발 기간 동안 세포와 조직 미래 동물 모양 변형 매우 재현 과정 이다. 같은 개 악 셀 수준1,2에서 세력의 적극적인 세대를 요구 하도록 표시 되었습니다. 세포와 조직 그들의 모양을 변경 하는 전체적 프로세스 이해, 그것은 따라서 키 참여, 세포의 기계적 특성을 평가 하 고 과정3,4 동안 조직 내의 힘을 측정 하 . 특히 초파리, 상피 레이어 인해 그들의 유사 2D 형상 및 그들의 쉬운 조작에 널리 공부 되었습니다.
다양 한 기술 따라서 우리가 다른 사람에 의해 개발 중 상피 역학에 vivo에서 평가 하기 위해 개발 되었습니다. 우리는 상피 조직에서 사용 하는 세 가지 주요 기술에 대 한 빠른 개요를 줄 것 이다. 레이저 제거, 널리 사용 되는 방법은 로컬 기계적 스트레스 세포 접속점5,6,,78 또는 더 큰 규모9,10,11 허용 로컬 인하 대상의 기계적 무결성 중단을 수행 하 여. 오프닝 컷 다음의 역학 관계와 조직12,13의 유동성 스트레스 이전 절제에 정보를 제공 합니다. 레이저 절제의 단점은 그것이 침략, 셀 피 로컬 중단을 필요로입니다. 하나 조직의 무결성을 유지 하 고 싶은 경우에 따라서, 하나만 제한 된 수의 제거를 수행할 수 있습니다. 또 다른 단점은 오프닝 속도 점성 마찰, 일반적으로 알려져 있지에 따라 달라 집니다 이후 제거 셀 연락처에서 긴장의 상대 견적 제공. 마그네틱 조작 개발 고 초파리, ferrofluids14 의 사용 또는 ultramagnetic 리15포함 사용 또한 있다. 그들은 절대 측정16,17을 제공할 수 있습니다 하지만 그들은 원하는 위치에 프로브의 주입 필요로 하는 의미에서 침략 적 있습니다. 이것은 항상 정확한 주사 의무가 시스템에 따라 매우 어려울 수 있습니다. 세 번째 기술은, 완전히 비-침략 적, 힘 유추18,,1920이다. 힘 유추 트리플 포인트 (tricellular 접합, 또는 정점)에서 기계적 평형의 가정에 그리고 셀 연락처 (그리고, 모든 셀에 압력)에 의해 역 문제 해결 전혀 긴장을 유추할 수 있습니다. 긴장, 각 꼭지점 두 식을 (X 및 Y)를 제공합니다. 이 셀의 모든 접촉에서 긴장을 평가 하기 위해 몇 가지 조건 하에서 반전 될 수 있는 선형 방정식의 큰 시스템을 생성 합니다. 세그먼트 이미지를 아무런 추가 실험 또는 설치만 요구 하는 때이 방법은 매우 매력적인, 동안 그것의 정확도 아직 결정, 그리고 다시만 제공 상대 값, 절대 교정 측정 수행 하지 않는 한.
이러한 한계 들을 극복 하기 위해 우리 소개이 문서에서는 광학 족집게의 설치 제어 세력 초파리 melanogaster의 배아 상피에 셀 규모에 적용할 빛 시트 현미경에 결합. 광학 핀셋 단일 단백질 및 세포와 세포21의 조작에 측정을 포함 하 여 수많은 생물 학적 응용에 대 한 사용 되었습니다. 여기, 우리가 작은 몇 다스 pN의 범위에서 적용 된 힘을 보고 아직 셀 연락처의 로컬 변형 유발 하 고 vivo에서기계 측정을 수행 하기에 충분. 일반적으로, 셀 연락처, kymographs의 분석을 통해 모니터링의 수직 편향 사용 하 여 변형 힘 관계. 중요 한 것은, 우리의 설치 광학 핀셋 직접 셀 연락처에 힘을 발휘할 수 있는 조직에서 원하는 위치에 구슬의 주입을 요구 하지 않는다. 빛 시트 현미경 광학 족집게의 결합 수의 조명부터 매우 감소 된 phototoxicity와 짧은 시간 스케일에서 기계적인 분석에 대 한 감지할 수 있는 빠른 영상 (초당 몇 프레임)을 수행 하는 샘플 영상22의 비행기로 제한 됩니다.
전반적으로, 광학 족집게는 셀 연락처 초파리 태아에서 vivo에서에서 제어 힘을 적용 하 고 경직과 긴장 셀 연락처23, 유 변 학적 특성 기계 정보를 추출 하는 비-침략 적 방법 24, 그리고 그라데이션 또는 긴장23의 이방성.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1377">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW</td>
			<td style="width:179px;">IPG Laser</td>
			<td style="width:179px;">YLM-10-LP-SC</td>
			<td style="width:591px;">including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">&#216;1/2&#34; Optical Beam Shutter</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">SH05</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Small Beam Diameter Galvanometer Systems</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GVS001</td>
			<td style="width:591px;">1 for X displacement, 1 for Y displacement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">1D or 2D Galvo System Linear Power Supply</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">GPS011</td>
			<td style="width:591px;">galvanometers power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">2 lenses f = 30mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1757-B</td>
			<td style="width:591px;">relay telescope between 2 galva</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 200mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1945-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Lens f = 500mm</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LB1869-B</td>
			<td style="width:591px;">2.5X telescope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">KCB1E</td>
			<td style="width:591px;">Periscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:428px;">Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style</td>
			<td style="width:179px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:179px;">LG1</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">45&#176; AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror</td>
			<td style="width:179px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:179px;">#64-470</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Multiphoton-Emitter HC 750/S</td>
			<td style="width:179px;">AHF</td>
			<td style="width:179px;">HC 750/SP</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">CompactDAQ Chassis</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">cDAQ-9178</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Output Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9263</td>
			<td style="width:591px;">Analog output module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">C Series Voltage Input Module</td>
			<td style="width:179px;">National Instruments</td>
			<td style="width:179px;">NI-9215</td>
			<td style="width:591px;">Analog input module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 &#181;m, red fluorescent (580/605), 2% solids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F8812</td>
			<td>calibration beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C++ (Qt) home made optical tweezers software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s. Alternative solution: labview</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probing cell mechanics with bead-free optical tweezers in the drosophila embryo

Morphogenesis 유전 패턴화와 견고 하 게 모양 세포와 조직에 기계적인 힘 사이 협력을 요구 한다. 따라서, 전체적 프로세스를 이해 하는 도전 직접 embryogenesis 동안 세포 세력과 vivo에서 기계적 성질을 측정 하는. 여기, 우리 초기 초파리 배아의 세포-세포 연락처에 군대를 직접 적용할 수 있는 가벼운 시트 현미경을 결합 하는 광학 족집게의 설정을 현재 초당 몇 프레임의 속도로 이미징 동안. 이 기술은 광학 힘 발휘는 중간 조사로 일반적으로 사용 되는 배아에 구슬의 주입을 요구 하지 않는 이점이 있다. 우리는 단계적으로 설치, 구현에 자세히 설명 하 고 실험에서 기계적인 정보를 추출 하는 도구를 제안. 실시간으로 셀 연락처의 변위를 모니터링 함으로써 한 긴장 측정을 수행 하 고 셀 연락처 유동성 조사 수 있습니다.

그림 5 함정을 정현파 움직임을 부과 하 여 얻어진 실험 데이터를 보여 줍니다. 함정 3 연속 인터페이스 위치 (그림 5A)23보여주는 3 스냅샷에 의해 exemplified 인터페이스의 편향도 생성 합니다. 기록된 영화 kymograph (그림 5B)를 생성 하는 데 사용 됩니다. 그리고 각 프레임에 대 한 x 방향을 따...

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Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

선물이 빛 시트 현미경을 초파리 태아에 구슬 없이 셀 역학을 구현 결합 광학 족집게의 설치.

초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

이 방법은 세포 세포 접촉의 속성이 조직 형태 발생 도중 공간과 시간에 있는 어떻게 변경되는지와 같은 조직 역학에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 약하게 침습적이며 광시트 현미경 검사법과 같은 라이브 이미징과 호환된다는 것입니다. 이 기술은 조직에 구슬의 주입을 필요로하지 않습니다.일반적으로 혜성을 얻을 수있는 데미에르 프로브로 사용, 나는 흥분. 이 과정을 시연하는 것은 제 지형 수준에서 연구 과학자인 샤르드(Chardes)와 라파엘 클레멘트(Raphael Clement)가 될 것입니다. 시작하려면, 수평 평야에서 광 시트 현미경 검사대에 대한 직립 현미경을 설정한 다음 광학 핀셋역할을 레이저와 광학을 준비합니다.다음으로 500나노미터형형구슬 1개를 유리 큐벳에 넣고 증류수 10밀리리터를 넣습니다. 큐벳 홀더를 목표 아래에 배치하고 목표가 수면에 닿을 수 있도록 목표의 초점을 조정합니다. 이제 인수 소프트웨어를 제어하는 데 사용되는 통합 개발 환경 QT 크리에이터를 엽니다.마이크로Rheo를 열어 획득 소프트웨어를 엽니다. 라이브를 선택하여 라이브 획득 모드를 켭니다. 레이저를 전환하기 전에 안전 고글을 착용한 다음 레이저 전력을 1와트로 조정하고 레이저를 켭니다.라이브 피드는 이제 레이저의 초점에 갇혀 구슬을 표시해야합니다. 필요한 경우 두 번째 망원경 렌즈의 위치를 조정하여 비드를 집중시다. 또한 이미지의 비드를 중심으로 잠망경 기동의 각도를 조정해야 할 수도 있습니다.첨부된 텍스트 프로토콜 의 그림 3에 설명된 대로 데이터 수집 보드 및 연석 연결을 준비합니다. 광학 셔터 인터페이스에서 시간 개방 초 매개변수를 000.000으로 조정하고, 시간 폐쇄 된 sec 매개 변수를 000.000으로, 모드 매개 변수를 단일으로 조정하고, 트리거 매개 변수를 EXT로 조정합니다. 설정이 완료되면 사용 설정 단추를 선택합니다.QT 크리에이터에서 ot를 엽니다. 프로젝트를 엽니다. aogenerator의 입력 및 출력 이름을 변경합니다.설정에 사용된 MI 카드와 일치하는 cpp 파일입니다. 마지막으로 광학 핀셋 소프트웨어를 컴파일하고 실행합니다. 획득 소프트웨어에서 원하는 노출 시간, 게임, 두 이미지 사이의 시간, 획득할 이미지 수 및 레이저의 전원을 선택합니다.그런 다음 광학 핀셋 소프트웨어에서 여기에 표시된 광학 핀셋 매개 변수를 설정하여 원을 추적합니다. 그런 다음 AI 매개 변수 상자, 무게 전달 상자를 확인하고 레코드 푸시 버튼을 누릅니다. 광학 핀셋을 켜고 생성 버튼을 선택하고, 갇힌 비드가 적어도 두 개의 전체 원을 완료한 다음 생성 버튼을 선택 해제하여 광학 핀셋을 중지할 수 있습니다.마지막으로 이미지 수집을 중지합니다. 티프 동영상과 갈바노미터 전압이 있는 텍스트 파일이 기본 폴더에 생성됩니다. Matlab을 열고 교정 폴더로 이동하여 위치 두 장력 스크립트를 실행스크립트는 보간 기능을 계산하여 갈바노미터 전압을 광학 트랩 위치로 변환합니다.다음으로, 캘리브레이션 동영상을 설정하기 위해 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라다. X 및 Y 레이저 위치에 대한 보간 맵을 계산하고 스크립트에 의해 제대로 표시되는지 확인합니다. 누락된 값을 나타내는 맵의 흰색 영역을 확인합니다.흰색 영역이 중요한 경우 새 교정 동영상으로 작업을 반복합니다. 여기에 표시된 교정 동영상은 적절한 데이터가 있는 영화를 나타냅니다. 파이크 또는 습한 브러시를 사용하여 원하는 단계에서 약 10개의 배아를 선택하고 정렬합니다.그런 다음 다이아몬드 마킹 펜을 사용하여 유리 슬라이드 조각을 10~20마일로 자른다. 절단 된 조각의 한쪽에 접착제를 추가하고 20 초 동안 건조 한 다음 절단 된 조각을 뒤집어 배아 라인에 놓고 슬라이드 가장자리에 붙입니다. 다음으로, 샘플 홀더에 준비를 설치하고 홀더를 큐벳에 넣고 피소 전기 상태에 큐벳을 놓고 물로 채웁니다.시작하려면 관심 위치를 찾아 피사 스테이지를 사용하여 대상 접합의 중간점을 레이저 트랩의 위치로 이동합니다. 접촉선에 수직으로 진동을 달성하기 위해 트랩의 매개 변수를 설정합니다. 또한 위상을 0으로 설정하고 X 및 Y 방향의 진폭은 접촉선에 수직으로 이동하도록 하고 진폭을 0.1 볼트로 설정합니다.이제 초당 10프레임과 같은 빠른 프레임 속도를 사용하여 인수를 시작합니다. 이미징이 시작되면 이동 푸시 버튼을 눌러 광학 핀셋을 켭갑니다. 이미징이 완료되면 핀셋을 끄고 이미지 수집을 중지합니다.지정된 폴더에 수집 중에 갈바노미터 전압이 포함된 동영상과 텍스트 파일이 있습니다. 수집된 프레임을 관찰하기 위해 동영상을 엽니다. 비디오의 분석에 따라 Matlab에서 비디오를 열어 조직 샘플의 강성과 장력을 측정합니다.여기서, 플롯 함수를 사용하여 인터페이스 위치를 트랩 위치의 함수로 플롯한다. 그런 다음 Matlab을 사용하기 쉬운 무료 도구 상자를 사용하여 데이터의 선형 맞춤을 수행합니다. 핏의 경사면의 역은 인터페이스 위치에 대한 트랩 위치의 평균 비율을 제공합니다.이 정보에서 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 방정식을 사용하여 강성 및 장력 값을 결정합니다. 레이저 트랩은 시료의 부비동성 편향을 생성하며, 이는 인터페이스에 수직입니다. 여기에 세 개의 연속 인터페이스 위치로 표시됩니다.또한 클리모그래프를 생성하는 영화로 기록할 수 있으며, 서브 픽셀 해상도를 가진 인터페이스의 위치를 결정하기 위해 추가로 분석될 수 있다. 여기서 기간은 5초였습니다. 작은 변형 정권에서 트랩과 인터페이스 위치는 비례합니다.트랩에 비해 인터페이스 편향의 진폭은 인터페이스 장력 또는 강성에 대한 액세스를 제공합니다. 여기에 풀 및 릴리스 실험의 기본이 표시됩니다. 광학 트랩이 켜지면 두 셀 사이의 인터페이스 중간점에서 약 1마이크로미터 떨어진 곳에 인터페이스가 트랩의 위치를 향해 편향됩니다.그런 다음 원하는 시간 이후에 트랩이 꺼져 있습니다. 결과 그래프는 모델과 같은 맥스웰과 같은 가설된 실제 논리 모델과 비교할 수 있습니다. DOn't 잊지 마세요 적외선 레이저와 함께 작업 하는 것은 매우 위험 할 수 있습니다., 그리고 보호 고글을 착용 등 예방 조치, 항상이 절차를 수행 하는 경우 촬영 해야.여기서, 배아의 팅클 핀셋에서 가장 빈번한 사용자와 함께, 방법은 또한 같은 다른 어머니 시스템에 사용될 수있다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

연구

발생학

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...