Name: tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Vi vil gerne takke Athanasios Papangelis, for kritiske kommentarer til manuskriptet. FM er støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP er støttet af American Heart Association videnskabsmand udvikling Grant (17SDG33060002).

Musen hjerte vævsprøver for denne undersøgelse blev indhentet i overensstemmelse med de relevante love og institutionelle retningslinjer og blev godkendt af Yale University institutionelle Animal Care og brug udvalget.
1. løsning forberedelse
<ol><li>Forberede RNase gratis ddH2O, ved at behandle Hedeselskabet2O 5 L, med 5 mL af 0,1% diethylpyrocarbonate (DEPC) natten over (O/N), ved stuetemperatur (RT). Autoklave (121 ° C) til at deaktivere DEPC. Brug DEPC-behandle...

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+primary+microRNAs+by+the+Microprocessor+complex.">Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex.</a> Nature. 432, 231-235 (2004).</li><li>Hutvagner, G., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+in+a+multiple-turnover+RNAi+enzyme+complex.">A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.</a> Science. 297, 2056-2060 (2002).</li><li>Krol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+microRNA+(miRNA)+precursors+and+their+relevance+to+miRNA+biogenesis+and+small+interfering+RNA/short+hairpin+RNA+design.">Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design.</a> Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).</li><li>Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+microRNA+genes.">Vertebrate microRNA genes.</a> Science. 299, 1540 (2003).</li><li>Tian, T., Wang, J., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+microRNA+detection+methods.">A review: microRNA detection methods.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).</li><li>Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+potentiate+neural+development.">MicroRNAs potentiate neural development.</a> Neuron. 64, 303-309 (2009).</li><li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).</li><li>Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-specific+MicroRNAs.">Embryonic stem cell-specific MicroRNAs.</a> Developmental cell. 5, 351-358 (2003).</li><li>Kasper, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Establish+Uniform+Traits+during+the+Architecture+of+Vertebrate+Embryos.">MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos.</a> Developmental cell. 40, 552-565 (2017).</li><li>Liu, N., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulatory+networks+in+cardiovascular+development.">MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development.</a> Developmental cell. 18, 510-525 (2010).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA+Interactome+in+Metabolic+Homeostasis.">The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).</li><li>Ying, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue+Macrophage-Derived+Exosomal+miRNAs+Can+Modulate+In+Vivo+and+In+Vitro+Insulin+Sensitivity.">Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.</a> Cell. 171, 372-384 (2017).</li><li>Perkins, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+expression+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia+and+schizoaffective+disorder.">microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder.</a> Genome biology. 8, R27 (2007).</li><li>Miller, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-132+dysregulation+in+schizophrenia+has+implications+for+both+neurodevelopment+and+adult+brain+function.">MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).</li><li>Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derepression+of+a+neuronal+inhibitor+due+to+miRNA+dysregulation+in+a+schizophrenia-related+microdeletion.">Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion.</a> Cell. 152, 262-275 (2013).</li><li>Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+psychiatric+disorders+with+a+focus+on+autism+spectrum+disorder:+Current+progress+in+genetic+association+studies,+expression+profiling,+and+translational+research.">MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research.</a> Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+microRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microRNA+expression+in+human+heart+disease.">Altered microRNA expression in human heart disease.</a> Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).</li><li>Mann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NF-kappaB-microRNA+regulatory+network+tunes+macrophage+inflammatory+responses.">An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses.</a> Nature Communications. 8, 851 (2017).</li><li>O'Connell, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+promotes+autoimmune+inflammation+by+enhancing+inflammatory+T+cell+development.">MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development.</a> Immunity. 33, 607-619 (2010).</li><li>Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+microRNAs:+from+subtype+profiling+to+predictors+of+response+to+therapy.">Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+component+of+the+p53+tumour+suppressor+network.">A microRNA component of the p53 tumour suppressor network.</a> Nature. 447, 1130-1134 (2007).</li><li>Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+microRNAs+in+animal+development+and+disease.">The diverse functions of microRNAs in animal development and disease.</a> Developmental cell. 11, 441-450 (2006).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-182+Modulates+Myocardial+Hypertrophic+Response+Induced+by+Angiogenesis+in+Heart.">miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart.</a> Science Reports. 6, 21228 (2016).</li><li>Meerson, F. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+hyperfunction+of+the+heart+and+cardiac+insufficiency.">Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency.</a> Circulation Research. 10, 250-258 (1962).</li><li>Tardiff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+hypertrophy:+stressing+out+the+heart.">Cardiac hypertrophy: stressing out the heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).</li><li>Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+ventricular+remodeling:+mechanisms:+part+1+of+2.">Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2.</a> Circulation. 128, 388-400 (2013).</li><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146-e603 (2017).</li><li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues.">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nature Methods. 6, 139-141 (2009).</li></ol>

miRNA udskrift afsløring kan opnås gennem forskellige teknikker, der varierer i følsomhed, specificitet og kvantitative magt. Her, vi påvise kobling af miRNA i situ hybridisering med immunfarvning og beskrive en protokol, der giver mulighed for samtidige vurdering af udtryk niveauer af miRNA og protein molekyler, på de samme hjerte sektioner. Først viser vi hvordan du udfører i situ hybridisering af grave-mærket LNA miRNA sonder på paraffinsnit indlejret hjerte. Næste, vi beskriver, hvordan du...

mikro-RNA'er (miRNAs) er korte (18 – 25 nukleotider), enkelt-strenget, noncoding RNA'er, der fungerer som negative regulatorer af genekspression på det post-transcriptional niveau af hæmme messenger RNA (mRNA) oversættelse og/eller fremme mRNA nedbrydning 1. miRNAs er transskriberet fra introner eller exons kodning eller noncoding gener og er kløvet i kernen af DROSHA, at forløber miRNAs (pre-miRNAs), som er korte stem-loop strukturer af 70 nukleotider2. Efter cytoplasmatisk eksport, pre-miRNAs forarbejdes yderligere af DICER til modne miRNAs, der strækker sig over 18 – 25 nukleotider3,4. Efterfølgende, indarbejder den RNA-induceret silencing complex (RISC) disse miRNAs som enkeltstrenget RNA'er, som gør det muligt for deres binding til den 3' utranslaterede region (3'-UTR) af deres mål mRNAs at undertrykke deres udtryk3,5 .
Inden for de sidste tre årtier, siden de blev først identificeret, opstået miRNAs til master regulatorer af genekspression, hvis eget udtryk niveauer er stramt kontrolleret6. Roller for miRNAs har været beskrevet i orgel udvikling7,8,9,10,11,12, opretholdelse af homeostase13,14 , samt sygdom sammenhænge, der omfatter neurologiske15,16,17,18,19, hjerte-kar-20, autoimmune sygdomme21 ,22, kræft23,24, og andre25. Den stigende forståelse for relevansen af miRNA udtryk mønstre har fremsat behovet for pålidelige påvisningsmetoder af miRNA udskrifter. Disse metoder omfatter Real Time PCR, microarrays, nordlige Blotting, i situ hybridisering og andre, som varierer i følsomhed, specificitet og kvantitative strøm, overvejende at miRNA udskrifter består af korte og stærkt homologe sekvenser6.
Vi har for nylig rapporteret en vigtig rolle for miRNA-182 i udvikling af myokardieinfarkt hypertrofi26, en tilstand, der beskriver den strukturelle tilpasning af hjertet som reaktion på forhøjet hæmodynamiske krav27,28. Hjertehypertrofi er karakteriseret ved stigning i Myokardie massen, som hvis forbundet med utilpasset remodeling29, kan føre til øget risiko for hjertesvigt, en tilstand, der tegner sig for 8,5% af alle dødsfald skyldes hjerte-kar- sygdom30.
Her beskriver vi vores protokol, der kombinerer i situ hybridisering med digoxigenin-mærket (grave) låst nukleinsyre (LNA) sonde og immunfarvning for samtidige påvisning af miRNA og protein molekyler på musen hjerte væv sektioner, i vores model af Hjertehypertrofi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>DEPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02038</td>
			<td>non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>ProK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 1 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 12 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methylimidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>336092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>39391</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td>H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Sodium Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>339450</td>
			<td>scramble miRNA/U6 snRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>YD00615701</td>
			<td>5&#39;-DIG and 3&#39;-DIG labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisol hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT/BCIP Tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11697471001</td>
			<td>NBT-BCIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P217</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic coverslip</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td>
			<td>RNA-ase free plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>DIG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Pap pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td>cTnT antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>anti-rabbit-568 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Formamide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>UVP HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization

mikro-RNA'er (miRNAs) er enkeltstrenget RNA afskrifter, der binder til messenger RNA'er (mRNAs) og hæmme deres oversættelse eller fremme deres nedbrydning. Til dato, har miRNAs været impliceret i en lang række biologiske og sygdom processer, som har tilkendegivet nødvendigheden af metoderne pålidelig detektering af miRNA udskrifter. Her beskriver vi en detaljeret protokol til digoxigenin-mærket (grave) låst nukleinsyre (LNA) sonde-baserede miRNA påvisning, kombineret med protein immunfarvning på musen hjerte sektioner. Vi uropført en i situ hybridisering teknik bruger sonden til at identificere miRNA-182 udtryk i hjertet sektioner fra kontrol og Hjertehypertrofi mus. Næste, vi udførte immunfarvning for kardiale Troponin T (cTnT) protein, på de samme strækninger, at co lokalisere miRNA-182 med cardiomyocyte celler. Ved hjælp af denne protokol, var vi købedygtig opdager miRNA-182 gennem en alkalisk fosfatase baseret kolorimetriske assay og cTnT gennem fluorescerende farvning. Denne protokol kan bruges til at registrere udtryk for enhver miRNA interesse gennem grave-mærket LNA sonder og relevante protein udtryk på musen hjerte væv sektioner.

miRNA i situ hybridisering var optimeret på musen hjerte sektioner ved hjælp af en scramble miRNA og U6-snRNA, der fungerede som negativ og positiv kontrol henholdsvis. Positive farvning er indiceret i blåt, mens den negative farvning er indiceret ved manglende farve udvikling (figur 1A-1B). Cardiomyocyte specifikt udtryk for miRNA-182 blev vurderet i hjertet sektioner fra kontrol og PlGF overekspression mus. Musene transporterer ...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Væv-specifikke miRNA udtryk profilering i mus hjerte sektioner ved hjælp af In Situ hybridisering

mikro-RNA'er (miRNAs) er korte og meget homologe RNA sekvenser, der tjener som post-transcriptional regulatorer af messenger RNA'er (mRNAs). Nuværende miRNA påvisningsmetoder varierer i følsomhed og specificitet. Vi beskriver en protokol, der kombinerer i situ hybridisering og immunfarvning for samtidige påvisning af miRNA og protein molekyler på musen hjerte væv sektioner.

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i microRNA-feltet ved at levere værktøjer til at detektere den relative lcalisering af både protein- og mikroRNA-molekyler. Den største fordel ved denne teknik er, at du kan detektere både protein- og mikroRNA-molekyler fra samme vævssektion. Denne protokol begynder med en rehydrering af det slidemonterede væv.Varm dias ved 60 grader Celsius i 10 minutter i hybridisering ovnen. Paraffinen skal være synligt smeltende. Derefter inkuberes diasene i et glas Coplin krukke, der indeholder kommercielt tilgængelige clearing agent i 10 minutter.Gør det to gange. Dernæst overføre dias fra vask til vask for at rehydrere væv. Når hydreret, inkuberes vævene i proteinase K arbejdsopløsning ved 37 grader Celsius i 15 minutter.For at fjerne proteinase K skal du vaske objektglassene i 1x PBS to gange. Nu, lave væv. Først skal du lave reservoirer på diasene ved hjælp af en hydrofob pen til at tegne en vandafvisende cirkel omkring præparaterne.Derefter anvendes 500 mikroliter 4% PFA-opløsning inden for barrieren, og inkuber diasene i en røghætte. For at fjerne fiksativet vaskes objektglassene i en Coplin-krukke, der indeholder PBS i fem minutter to gange ved stuetemperatur. Dernæst vaskes diasene i 0,13 molar 1-Methylimidazol i 10 minutter.Gør dette i røghætten ved stuetemperatur, og udfør denne vask to gange. Tilsæt EDC fiksativ, og inkubere ved stuetemperatur i en røghætte i en time. Skyl rutsjebanerne med 50 millimolar Tris.For at forberede hybridiseringen skal du først bygge et befugtet kammer. Læg to stykker filter eller silkepapir i bunden af en kasse, og våd papiret med en en-til-en blanding af formamid og 1x SSC. Dernæst anvende 200 mikroliter af forvarperede hybridisering løsning på hvert dias, og inkubere befugtede kammer af dias i en til tre timer ved 50 grader Celsius.Efter inkubationen udskiftes hybridiseringsopløsningen med 250 mikroliter sondeopløsning, og objektglassene dækkes med en RNase-fri dæksel slip. Prøv at undgå at fange luftbobler under dækslet slip. Nu forsigtigt forsegle kammeret med parafilm, og inkubere dias natten over på ca 30 grader Celsius under RNA smeltetemperatur af sonden.Optimering kan være påkrævet. Ud over at indstille den rigtige inkubationstemperatur udtrykkes forskellige mikroRNA'er på forskellige niveauer, så optimering vedrørende sondekoncentrationen kan også være nødvendig for at få det optimale signal. Efter hybridiseringen skal du udføre strenghedsvasken.Første, var i 2x SSC ved 50 grader Celsius i fem minutter, eller indtil dækslet glider løsne. Derefter udføre to vasker i 2x SSC ved stuetemperatur, hver i fem minutter. Derefter fortsætter ved stuetemperatur, vask dias i fem minutter i 0,2 x SSC, efterfulgt af fem minutter i PBST, og endelig, fem minutter i 1x PBS.På dette tidspunkt er RNA-RNA-hybriderne stabile, og RNA-strenge betingelser er ikke længere nødvendige. For DIG antistof detektion, først, røre op hydrofobe barrierer, og anvende 500 mikroliter af blokerende opløsning i tredive minutter. Inkuber rutsjebanerne ved stuetemperatur i et befugtet kammer.Fjern derefter blokeringsopløsningen, og udskift den med 500 mikroliter DIG-antistofopløsning. Inkuber rutsjebanerne ved stuetemperatur i et befugtet kammer i en time. Vask derefter objektglassene tre gange i PBST i fem minutter pr. vask ved hjælp af Coplin-krukker.Vask derefter objektglassene i forfarvningsopløsning i fem minutter to gange. Overfør derefter diasene til en polypropylen slide mailer krukke, og tilsæt 20 milliliter AP substrat opløsning. Nu inkubere dias ved 37 grader Celsius i seks til 24 timer, beskyttet mod lyset.Når du først bruger AP substrat, er det vigtigt at følge reaktionen. På to timers intervaller skal du kontrollere farveudviklingen på diasene ved hjælp af et mikroskop, indtil der er fastlagt en optimal inkubationstid. For at fjerne det overskydende AP-underlag vaskes objektglassene to gange i KTBT-opløsning i fem minutter pr. vask efterfulgt af en vask i PBS i fem minutter.For at opdage cTNT antistof, først, blokere væv i en time. Derefter anvende 200 mikroliter af cTNT antistof opløsning, og inkubere dias natten over ved 4 grader Celsius i et befugtet kammer. Den næste dag, vaske dias i en Coplin krukke, der indeholder PBS i fem minutter.Gør det tre gange. Derefter anvende 250 mikroliter af anti-kanin 568 antistof opløsning, og inkubere dias i en time ved stuetemperatur i et befugtet kammer. For at vaske det overskydende sekundære antistof ud skal du bruge tre fem minutters vaske i PBS.Derefter, hvis det ønskes, anvende 250 mikroliter af DAPI arbejdsløsning, og inkubere dias i et minut, beskyttet mod lys. For at fjerne den overskydende DAPI-plet skal du bruge to fem minutters PBS-vasker, og efter vaskene skal du montere objektglassene. MicroRNA in-situ hybridisering blev optimeret på musehjertesektioner ved hjælp af et forvrænget mikroRNA for negativ kontrol og et U6 snRNA som en positiv kontrol.Kardiomyocyt-specifikt udtryk for microRNA-182 blev vurderet i hjertesektioner fra kontrol og PlGF-overexpresserende mus. Musene bar en PlGF transgene under en alfa-MHC promotor, og udviklede hjertehypertrofi, sekundært til øget angiogenese, inden for seks uger efter transgene aktivering. Farvningsprotokollen afslørede øget ekspression af microRNA-182 i hjerterne på PlGF-mus.Dernæst for at bestemme, hvilke celletyper der er udtrykt mikroRNA-182, blev de samme sektioner immunstained for cTNT. DAPI farvning blev også brugt. I både kontrol og PlGF mus hjerte sektioner, microRNA-182 blev fundet i det nukleare rum af cTNT-positive cardiomyocyte celler.Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man udfører microRNAse hybridisering, efterfulgt af protein immunostaining. Mens du forsøger denne procedure, er det meget vigtigt at huske at holde RNAse-fri betingelser i hele dag ét, under alle trin, der fører op til prop hybridisering. Efter denne procedure, andre metoder som Western blot i en real-time PCR kan udføres for at besvare spørgsmål som, hvad er de relative udtryksniveauer af denne særlige microRNA i forskellige væv, eller denne særlige protein i samme væv sektion.Glem ikke, at arbejde med fiksativer som PFA og ADC kan være ekstremt farligt. Forholdsregler, omfatter iført handsker og lab frakker, samt ved hjælp af røg hætter, bør altid tages, når du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Mærkning af mitokondrie-DNA Replication i Drosophila Adult Ovarier af Edu Farvning

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Måling af døgnrytmen ur genekspression og hormon sekretion i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Tilfældig mutagenese ved anvendelse histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Påvisning af Inter-kromosomale Stabil Afvigelser fra Multiple Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (MFISH) og Spectral Karyotyping (SKY) i bestrålede mus

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikation Timing ved hjælp af zebrafisk som en In Vivo modelsystem.

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering af mikrobiota i kryds tarme af hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...