Name: tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

ברצוננו להודות אנטאנאסיוס Papangelis, על תגובות ביקורתיות על כתב היד. FM נתמך על-ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC; BB/M009424/1). IP נתמך על ידי האמריקאי הלב האגודה מדען פיתוח המענק (17SDG33060002).

העכבר דגימות רקמות הלב במחקר זה התקבלו בדרישות הרלוונטיות חוקים והנחיות מוסדיים ואושרו על-ידי ייל אוניברסיטת אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.
1. פתרון הכנה
<ol><li>הכנת RNase ddH חינם2O, על ידי טיפול 5 L של ddH2O עם 5 מ של 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) בין לילה (O/N), בטמפרטורת החדר (RT). אוטוק...

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+primary+microRNAs+by+the+Microprocessor+complex.">Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex.</a> Nature. 432, 231-235 (2004).</li><li>Hutvagner, G., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+in+a+multiple-turnover+RNAi+enzyme+complex.">A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.</a> Science. 297, 2056-2060 (2002).</li><li>Krol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+microRNA+(miRNA)+precursors+and+their+relevance+to+miRNA+biogenesis+and+small+interfering+RNA/short+hairpin+RNA+design.">Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design.</a> Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).</li><li>Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+microRNA+genes.">Vertebrate microRNA genes.</a> Science. 299, 1540 (2003).</li><li>Tian, T., Wang, J., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+microRNA+detection+methods.">A review: microRNA detection methods.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).</li><li>Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+potentiate+neural+development.">MicroRNAs potentiate neural development.</a> Neuron. 64, 303-309 (2009).</li><li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).</li><li>Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-specific+MicroRNAs.">Embryonic stem cell-specific MicroRNAs.</a> Developmental cell. 5, 351-358 (2003).</li><li>Kasper, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Establish+Uniform+Traits+during+the+Architecture+of+Vertebrate+Embryos.">MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos.</a> Developmental cell. 40, 552-565 (2017).</li><li>Liu, N., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulatory+networks+in+cardiovascular+development.">MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development.</a> Developmental cell. 18, 510-525 (2010).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA+Interactome+in+Metabolic+Homeostasis.">The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).</li><li>Ying, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue+Macrophage-Derived+Exosomal+miRNAs+Can+Modulate+In+Vivo+and+In+Vitro+Insulin+Sensitivity.">Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.</a> Cell. 171, 372-384 (2017).</li><li>Perkins, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+expression+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia+and+schizoaffective+disorder.">microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder.</a> Genome biology. 8, R27 (2007).</li><li>Miller, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-132+dysregulation+in+schizophrenia+has+implications+for+both+neurodevelopment+and+adult+brain+function.">MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).</li><li>Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derepression+of+a+neuronal+inhibitor+due+to+miRNA+dysregulation+in+a+schizophrenia-related+microdeletion.">Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion.</a> Cell. 152, 262-275 (2013).</li><li>Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+psychiatric+disorders+with+a+focus+on+autism+spectrum+disorder:+Current+progress+in+genetic+association+studies,+expression+profiling,+and+translational+research.">MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research.</a> Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+microRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microRNA+expression+in+human+heart+disease.">Altered microRNA expression in human heart disease.</a> Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).</li><li>Mann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NF-kappaB-microRNA+regulatory+network+tunes+macrophage+inflammatory+responses.">An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses.</a> Nature Communications. 8, 851 (2017).</li><li>O'Connell, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+promotes+autoimmune+inflammation+by+enhancing+inflammatory+T+cell+development.">MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development.</a> Immunity. 33, 607-619 (2010).</li><li>Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+microRNAs:+from+subtype+profiling+to+predictors+of+response+to+therapy.">Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+component+of+the+p53+tumour+suppressor+network.">A microRNA component of the p53 tumour suppressor network.</a> Nature. 447, 1130-1134 (2007).</li><li>Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+microRNAs+in+animal+development+and+disease.">The diverse functions of microRNAs in animal development and disease.</a> Developmental cell. 11, 441-450 (2006).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-182+Modulates+Myocardial+Hypertrophic+Response+Induced+by+Angiogenesis+in+Heart.">miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart.</a> Science Reports. 6, 21228 (2016).</li><li>Meerson, F. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+hyperfunction+of+the+heart+and+cardiac+insufficiency.">Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency.</a> Circulation Research. 10, 250-258 (1962).</li><li>Tardiff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+hypertrophy:+stressing+out+the+heart.">Cardiac hypertrophy: stressing out the heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).</li><li>Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+ventricular+remodeling:+mechanisms:+part+1+of+2.">Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2.</a> Circulation. 128, 388-400 (2013).</li><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146-e603 (2017).</li><li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues.">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nature Methods. 6, 139-141 (2009).</li></ol>

זיהוי תעתיק miRNA יכולה להיות מושגת באמצעות טכניקות שונות המשתנות רגישות, ירידה לפרטים, כוח כמותית. . הנה, נדגים את צימוד miRNA בחיי עיר הכלאה עם immunostaining. ומתארות פרוטוקול המאפשר להערכת בו-זמניות של רמות הביטוי של מולקולות miRNA, חלבון, על הלב הנוכשה. אנו הראשונים מראים כיצד לבצע בחיי עיר ?...

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם קצרים (18 – 25 נוקלאוטידים), RNAs חד-גדילי, noncoding המתפקדים הרגולטורים שלילי של ביטוי גנים ברמת post-transcriptional על ידי עיכוב תרגום RNA שליח (mRNA) ו/או קידום mRNA השפלה 1. miRNAs הם עיבד אינטרונים או exons של קידוד או noncoding גנים והם ביקע בגרעין על-ידי DROSHA, כדי קודמן miRNAs (pre-miRNAs), אשר הם גזע-לולאת מבנים של נוקלאוטידים 702. בעקבות cytoplasmic לייצא, pre-miRNAs מעובדים נוספים על ידי לטעמים לתוך miRNAs בוגרת המתפרסים על פני 18 – 25 נוקלאוטידים3,4. לאחר מכן, המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) משלבת miRNAs האלה כמו RNAs חד-גדילי, המאפשר את הכריכה שלהם לאזור 3' לא מתורגם (3'-UTR) של mRNAs היעד שלהם כדי לדכא את הביטוי3,5 .
בתוך שלושה עשורים, מאז שהם זוהו קודם, miRNAs הופיעו על הרגולטורים מאסטר של ביטוי גנים, רמות הביטוי האישי שלו הם מגבילים6. תפקידים miRNAs תוארו אורגן פיתוח7,8,9,10,11,12, תחזוקה של הומאוסטזיס13,14 , כמו גם מחלות בהקשרים הכוללים נוירולוגיות15,16,17,18,19,20לב וכלי דם, מחלות אוטואימוניות21 ,22,23,סרטן24ועוד25. הערכה הגוברת על הרלוונטיות של דפוסי ביטוי miRNA הביא קדימה את הצורך בשיטות זיהוי אמין של הפרוטוקולים miRNA. שיטות כאלה כוללות PCR בזמן אמת, מיקרו-מערכים, סופג בצפון, הכלאה בחיי עיר ועוד, אשר להשתנות רגישות, ירידה לפרטים, ובכוחו כמותית, בעיקר בשל העובדה כי miRNA תעתיקים המורכב מעובדים קצר ו רצפים הומולוגיים מאוד6.
לאחרונה דווח כאן תפקיד חשוב עבור miRNA-182 בפיתוח של שריר הלב היפרטרופיה26, מצב המתארת הסתגלות מבנית של הלב בתגובה לדרישות מוגברות בגרימת27,28. היפרטרופיה מאופיין על-ידי הגדלת מסת שריר הלב, אשר, אם המשויך שיפוץ maladaptive29, יכול להוביל לסיכון מוגבר לאי ספיקת לב, תנאי החשבונאי 8.5% ממקרי המוות כל המיוחס לב וכלי דם מחלת30.
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו המשלבת בחיי עיר הכלאה עם התווית על-ידי digoxigenin בדיקה (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם), immunostaining איתור בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר, ב שלנו דגם של היפרטרופיה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>DEPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02038</td>
			<td>non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>ProK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 1 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 12 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methylimidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>336092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>39391</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td>H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Sodium Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>339450</td>
			<td>scramble miRNA/U6 snRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>YD00615701</td>
			<td>5&#39;-DIG and 3&#39;-DIG labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisol hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT/BCIP Tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11697471001</td>
			<td>NBT-BCIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P217</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic coverslip</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td>
			<td>RNA-ase free plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>DIG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Pap pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td>cTnT antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>anti-rabbit-568 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Formamide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>UVP HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization

מיקרו-RNAs (miRNAs) הן תעתיקים RNA חד-גדילי לאגד RNAs שליח (mRNAs) ו לעכב את התרגום שלהם או לקדם את שפלותם. עד כה, miRNAs היו מעורבים מספר רב של תהליכים ביולוגיים ומחלות, אשר יש למסומן את הצורך בשיטות זיהוי אמין של תעתיקים miRNA. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לגילוי התווית על-ידי digoxigenin (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם) המבוסס על בדיקה miRNA, בשילוב עם חלבון immunostaining על העכבר לב חלקים. ראשית, אנו לבצע בחיי עיר הכלאה טכניקה באמצעות המכשיר לזיהוי miRNA-182 ביטוי בסעיפים הלב של שליטה ועכברים היפרטרופיה. הבא, נוכל לבצע immunostaining לב החלבונים טרופונין T (cTnT), על הסעיפים זהה, כדי להתאים לשפה משותפת miRNA-182 עם תאי cardiomyocyte. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לזהות miRNA-182 דרך phosphatase אלקליין המבוסס על ערכי צבע מוחלטים assay, cTnT דרך מכתים פלורסנט. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות את הביטוי של כל miRNA עניין באמצעות מגבר קדם התווית על-ידי החפירה הגששים, וביטוי חלבון הרלוונטיים במקטעי רקמת הלב העכבר.

miRNA בחיי עיר הכלאה אופטימלי במקטעי הלב העכבר באמצעות לטרוף miRNA U6-snRNA, אשר שימש ואתאיזם הפקדים בהתאמה. צביעת חיובי מסומן בכחול, בעוד ההכתמה שלילי הוא הצביע על ידי חוסר צבע פיתוח (איור 1A-1B). Cardiomyocyte ביטוי מסוים של miRNA-182 הוערכה בסעיפים הלב של שליטה ?...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם רצפי RNA הומולוגי מאוד וקצר, הגשה הרגולטורים post-transcriptional RNAs שליח (mRNAs). שיטות איתור miRNA הנוכחית להשתנות רגישות. אנו מתארים פרוטוקול המשלבת בחיי עיר הכלאה immunostaining לגילוי בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר.

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום microRNA, על ידי מתן כלים כדי לזהות את lcalization היחסי של מולקולות חלבון ומיקרו-רנ"א. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול לזהות הן מולקולות חלבון microRNA מאותו קטע רקמה. פרוטוקול זה מתחיל בהידרציה מחדש של הרקמות המותקנות על החלקה.מחממים את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתנור ההכלאה. הפרפין צריך להיות נמס בעליל. לאחר מכן, הדגירה את המגלשות בצנצנת קופלין זכוכית המכילה חומר ניקוי זמין מסחרית במשך 10 דקות.תעשה את זה פעמיים. לאחר מכן, להעביר את השקופיות מן לשטוף לשטוף כדי rehydrate את הרקמות. לאחר הידראט, דגירה את הרקמות פרוטאינאז K פתרון עבודה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.כדי להסיר את proteinase K, לשטוף את השקופיות ב 1x PBS פעמיים. עכשיו, לתקן את הרקמות. ראשית, לעשות מאגרים על המגלשות באמצעות עט הידרופובי לצייר מעגל דוחה מים סביב ההכנות.לאחר מכן, להחיל 500 microliters של פתרון 4%PFA בתוך המכשול, ו דגירה את השקופיות במכסה המנוע אדים. כדי להסיר את התיקון, לשטוף את השקופיות בצנצנת קופלין המכיל PBS במשך חמש דקות פעמיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות ב 0.13 טוחן 1-Methylimidazole במשך 10 דקות.לעשות את זה במכסה המנוע אדים בטמפרטורת החדר, ולבצע לשטוף את זה פעמיים. מוסיפים את התיקון EDC, ו דגירה בטמפרטורת החדר במכסה המנוע אדים במשך שעה אחת. לשטוף את השקופיות עם טריס 50 מילימולר.כדי להתכונן להכלאה, ראשית לבנות תא לח. לטעון שתי חתיכות של מסנן או נייר טישו לתוך החלק התחתון של קופסה, ולהרטיב את הנייר עם תערובת של אחד לאחד של formamide ו 1x SSC. לאחר מכן, להחיל 200 microliters של פתרון הכלאה מחומם מראש על כל שקופית, ולהדגיר את התא לח של שקופיות במשך שעה עד שלוש שעות ב 50 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, החלף את פתרון ההכלאה ב-250 מיקרוליטרים של פתרון בדיקה, וכסה את השקופיות בפתק כיסוי נטול RNase. נסו להימנע מלכידה של בועות אוויר מתחת לפתק הכיסוי. עכשיו, בזהירות לאטום את התא עם parafilm, ולהודגר את המגלשות לילה בכ 30 מעלות צלזיוס מתחת לטמפרטורת המסת RNA של החללית.ייתכן שיהיה צורך במיטוב. בנוסף לקביעת טמפרטורת הדגירה הנכונה, microRNAs שונים באים לידי ביטוי ברמות שונות, ולכן אופטימיזציה לגבי ריכוז החללית עשויה להידרש גם כדי לקבל את האות האופטימלי. לאחר ההכלאה, בצע את שטיפות ההמחשה.ראשית, היה ב 2x SSC ב 50 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, או עד הכיסוי מחליק להשתחרר. לאחר מכן, לבצע שתי שטיפות ב 2x SSC בטמפרטורת החדר, כל אחד במשך חמש דקות. לאחר מכן, ממשיך בטמפרטורת החדר, לשטוף את השקופיות במשך חמש דקות ב 0.2x SSC, ואחריו חמש דקות PBST, ולבסוף, חמש דקות ב 1x PBS.בשלב זה, היברידיות RNA-RNA יציבים, ותנאים מחמירים RNA כבר לא נחוצים. לגילוי נוגדנים DIG, ראשית, לגעת במחסומים הידרופוביים, ולהחיל 500 microliters של פתרון חסימה במשך שלושים דקות. הדגירה את המגלשות בטמפרטורת החדר בתא לח.לאחר מכן, הסר את פתרון החסימה והחלף אותו ב-500 מיקרוליטרים של פתרון נוגדני DIG. הדגירה את המגלשות בטמפרטורת החדר בתא לח במשך שעה. לאחר מכן, באמצעות צנצנות קופלין, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST במשך חמש דקות לכל לשטוף.לאחר מכן, לשטוף את השקופיות בתתכנון מכתים מראש במשך חמש דקות פעמיים. לאחר מכן, העבר את השקופיות לצנצנת דיוור שקופיות פוליפרופילן, והוסף 20 מיליליטר של פתרון מצע AP. עכשיו, הדגירה את המגלשות ב37 מעלות צלזיוס במשך שש עד 24 שעות, מוגן מפני האור.בעת השימוש הראשון במצע AP, חשוב לעקוב אחר התגובה. במרווחי זמן של שעתיים, בדוק את התפתחות הצבע בשקופיות באמצעות מיקרוסקופ, עד שנקבע זמן דגירה אופטימלי. כדי להסיר את מצע AP עודף, לשטוף את השקופיות פעמיים בפתרון KTBT במשך חמש דקות לכל לשטוף, ואחריו לשטוף אחד PBS במשך חמש דקות.כדי לזהות את הנוגדן cTNT, הראשון, לחסום את הרקמות במשך שעה. לאחר מכן, להחיל 200 microliters של פתרון נוגדן cTNT, ולהדגיר את המגלשות לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא לח. למחרת, לשטוף את השקופיות בצנצנת קופלין המכיל PBS במשך חמש דקות.תעשה את זה שלוש פעמים. לאחר מכן, להחיל 250 microliters של פתרון נוגדנים נגד ארנב 568, ולהדגיר את המגלשות במשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח. כדי לשטוף את הנוגדן המשני העודף, השתמש בשלושה שטיפות של חמש דקות ב- PBS.לאחר מכן, אם תרצה, להחיל 250 microliters של פתרון עבודה DAPI, ולהדק את השקופיות במשך דקה אחת, מוגן מפני אור. כדי להסיר את כתם ה- DAPI העודף, השתמש בשתי שטיפות PBS של חמש דקות ולאחר השטיפה, תן את השקופיות. ההכלאה MicroRNA in-situ היה אופטימיזציה על חלקי לב העכבר באמצעות microRNA מקושקשות לשליטה שלילית, ו U6 snRNA כשליטה חיובית.ביטוי ספציפי לקרדיומיוציט של microRNA-182 הוערך בחלקי לב משליטה ועכברים בדיכוי יתר של PlGF. העכברים נשאו טרנסג'נדר PlGF תחת מקדם אלפא-MHC, ופיתחו היפרטרופיה לבבית, משנית לאנגיוגנזה מוגברת, תוך שישה שבועות מהפעלת הטרנסג'ין. פרוטוקול הכתמים חשף ביטוי מוגבר של microRNA-182 בליבם של עכברי PlGF.לאחר מכן, כדי לקבוע אילו סוגי תאים מבוטאים microRNA-182, אותם חלקים היו immunostained עבור cTNT. נעשה שימוש גם בכתמי DAPI. הן בבקרה והן בקטעי לב עכבר PlGF, microRNA-182 נמצא בתא הגרעיני של תאי קרדיומיוציט חיוביים cTNT.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבצע הכלאה microRNAse, ואחריו immunostaining חלבון. בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור לשמור על תנאים ללא RNAse לאורך כל היום הראשון, במהלך כל השלבים המובילים כדי לתמוך הכלאה. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו כתם מערבי PCR בזמן אמת ניתן לבצע כדי לענות על שאלות כמו, מהן רמות הביטוי היחסי של microRNA מסוים זה ברקמות שונות, או חלבון מסוים זה באותו סעיף רקמות.אל תשכח כי עבודה עם fixatives כגון PFA ו- ADC יכול להיות מסוכן מאוד. אמצעי זהירות, כולל ללבוש כפפות חלוקי מעבדה, כמו גם באמצעות ברדסים אדים, תמיד צריך להינקט בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...