Name: tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00
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Vorremmo ringraziare Athanasios Papangelis, per osservazioni critiche sul manoscritto. FM è supportato dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP è supportato da American Heart Association scienziato Development Grant (17SDG33060002).

Campioni di tessuto di cuore di mouse per questo studio sono stati ottenuti in conformità con le leggi e le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal comitato di uso e di Yale University istituzionale Animal Care.
1. soluzione preparazione
<ol><li>Preparare la RNasi free ddH2O, trattando 5L di ddH2O con 5 mL di 0,1% dietilpirocarbonato (DEPC) durante la notte (O/N), a temperatura ambiente (TA). Sterilizzare in autoclave (121 ° C) per disattivare il DEPC. Us...

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+primary+microRNAs+by+the+Microprocessor+complex.">Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex.</a> Nature. 432, 231-235 (2004).</li><li>Hutvagner, G., Zamore, P. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues.">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nature Methods. 6, 139-141 (2009).</li></ol>

rilevazione di miRNA trascrizione può essere raggiunto attraverso tecniche diverse che variano nella sensibilità, specificità e potere quantitativa. Qui, dimostriamo l'accoppiamento di miRNA ibridazione in situ con immunostaining e descrivere un protocollo che consente la valutazione simultanea dei livelli di espressione di miRNA e proteina molecole, le stesse sezioni di cuore. Abbiamo in primo luogo mostrano come eseguire ibridazione in situ di scavare-contrassegnato LNA miRNA sonde su sezioni di cu...

micro-RNA (Mirna) è brevi (18 – 25 nucleotidi), singolo filamento, non codificanti RNA che fungono da regolatori negativi della espressione genica a livello post-trascrizionale inibendo la traduzione di RNA messaggero (mRNA) e/o promuovere la degradazione di mRNA 1. i miRNA sono trascritti da introni o essoni di codifica o di geni non codificanti e sono spaccati nel nucleo di DROSHA, al precursore Mirna (pre-miRNA), che sono strutture di breve gambo-ciclo di 70 nucleotidi2. Seguendo citoplasmico esportare, pre-miRNA vengono ulteriormente elaborati con DICER in Mirna maturi che si estendono su 18 – 25 nucleotidi3,4. Successivamente, il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) incorpora questi miRNA come single-stranded RNA, che per il loro legame la regione 3' non tradotta (3'-UTR) del loro mRNA bersaglio consente di sopprimere la loro espressione3,5 .
Negli ultimi tre decenni, poiché in primo luogo sono stati identificati, Mirna sono emerse al Maestro regolatori dell'espressione genica, i cui livelli di espressione sono strettamente controllato6. Ruoli per i miRNA sono stati descritti in organo sviluppo7,8,9,10,11,12, mantenimento della omeostasi13,14 , così come contesti di malattia che includono neurologico15,16,17,18,19, cardiovascolare20, patologie autoimmuni21 ,22, cancri23,24e altri25. Il crescente apprezzamento per la rilevanza dei modelli di espressione di miRNA ha portato avanti la necessità di metodi di rilevazione affidabili delle trascrizioni di miRNA. Tali metodi includono la Real Time PCR, microarray, Northern Blotting, ibridazione in situ e altri, che variano per la sensibilità, la specificità e la potenza quantitativa, principalmente dovuto al fatto che miRNA trascrizioni sono costituite da brevi e sequenze altamente omologhe6.
Recentemente abbiamo segnalato un importante ruolo dei miRNA-182 nello sviluppo dell'ipertrofia del miocardio26, una condizione che descrive l'adeguamento strutturale del cuore in risposta a richieste emodinamiche elevati27,28. L'ipertrofia cardiaca è caratterizzata dall'aumento della massa miocardica, che, se associato con rimodellamento maladattativo29, può condurre al rischio aumentato per insufficienza cardiaca, una condizione pari al 8,5% di tutti i decessi attribuibili a cardiovascolare malattia30.
Qui, descriviamo il nostro protocollo che combina l'ibridazione in situ con sonda di acido nucleico (DIG) bloccato (LNA) e immunostaining per la rilevazione simultanea di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo, digoxigenin-labeled in nostro modello dell'ipertrofia cardiaca.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>DEPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02038</td>
			<td>non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>ProK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 1 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 12 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methylimidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>336092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>39391</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td>H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Sodium Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>339450</td>
			<td>scramble miRNA/U6 snRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>YD00615701</td>
			<td>5&#39;-DIG and 3&#39;-DIG labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisol hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT/BCIP Tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11697471001</td>
			<td>NBT-BCIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P217</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic coverslip</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td>
			<td>RNA-ase free plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>DIG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Pap pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td>cTnT antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>anti-rabbit-568 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Formamide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>UVP HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization

micro-RNA (Mirna) è trascritti di RNA singolo filamento che associare a RNA messaggeri (mRNA) e inibiscono la loro traduzione o promuovono la loro degradazione. Ad oggi, i miRNA sono stati implicati in un gran numero di processi biologici e malattia, che ha significato la necessità per i metodi di rilevamento affidabile delle trascrizioni di miRNA. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione basata su probe miRNA (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) digoxigenin-etichettati, combinati con proteine immunostaining su sezioni di cuore di topo. In primo luogo, abbiamo effettuato una tecnica in situ di ibridazione con la sonda per identificare espressione di miRNA-182 in sezioni di cuore da controllo e ipertrofia cardiaca nei topi. Successivamente, abbiamo effettuato immunostaining per la proteina cardiaca troponina T (cTnT), sulle stesse sezioni, a co-localizzano miRNA-182 con le cellule del cardiomyocyte. Usando questo protocollo, siamo stati in grado di rilevare miRNA-182 attraverso una fosfatasi alcalina basato su analisi colorimetrica e cTnT attraverso colorazione fluorescente. Questo protocollo può essere usato per rilevare l'espressione di qualsiasi miRNA di interesse attraverso sonde Scavare-contrassegnate LNA e l'espressione della proteina rilevanti su sezioni di tessuto di cuore di topo.

ibridazione in situ di miRNA è stata ottimizzata su sezioni di cuore di topo utilizzando un scramble miRNA e U6-snRNA, che servivano come controlli positivi e negativi, rispettivamente. La macchiatura positiva è indicata in blu, mentre la macchiatura negativa è indicata dalla mancanza di sviluppo del colore (Figura 1A-1B). Cardiomyocyte espressione specifica dei miRNA-182 è stata valutata in sezioni di cuore da topi sovraesprimen...

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Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

micro-RNA (Mirna) è brevi e altamente omologhi sequenze di RNA, che serve come regolatori trascrizionali di RNA messaggeri (mRNA). Attuali metodi di rilevazione di miRNA variano nella sensibilità e specificità. Descriviamo un protocollo che unisce l'ibridazione in situ e immunostaining per il rilevamento simultaneo di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo.

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dei microRNA, fornendo strumenti per rilevare la relativa lcalizzazione delle molecole di proteine e microRNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile rilevare molecole di proteine e microRNA dalla stessa sezione tissutale. Questo protocollo inizia con una reidratazione dei tessuti montati sul vetrino.Riscaldare gli scivoli a 60 gradi Celsius per 10 minuti nel forno di ibridazione. La paraffina dovrebbe sciogliersi visibilmente. Quindi, incubare le diapositive in un barattolo di coplin di vetro contenente agente di compensazione disponibile in commercio per 10 minuti.Fallo due volte. Successivamente, trasferire le diapositive dal lavaggio al lavaggio per reidratare i tessuti. Una volta idratato, incubare i tessuti nella soluzione di lavoro proteinasi K a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Per rimuovere la proteinasi K, lavare le diapositive in 1x PBS due volte. Ora, aggiusta i tessuti. In primo luogo, creare serbatoi sugli scivoli usando una penna idrofobica per disegnare un cerchio idrorepellente intorno ai preparati.Successivamente, applicare 500 microlitri di soluzione di PFA al 4% all'interno della barriera e incubare i vetrini in una cappa aspirante. Per rimuovere il fissatore, lavare le diapositive in un barattolo coplin contenente PBS per cinque minuti due volte a temperatura ambiente. Quindi, lavare gli scivoli in 0,13 molare 1-metillimidazolo per 10 minuti.Fare questo nella cappa dei fumi a temperatura ambiente ed eseguire questo lavaggio due volte. Aggiungere il fissatore EDC e incubare a temperatura ambiente in una cappa aspirante per un'ora. Risciacquare le diapositive con Tris da 50 millimolare.Per prepararsi all'ibridazione, costruire prima una camera umidificata. Caricare due pezzi di filtro o carta velina nella parte inferiore di una scatola e bagnare la carta con una miscela uno-a-uno di formamide e 1x SSC. Successivamente, applicare 200 microlitri di soluzione di ibridazione preri warmed su ogni diapositiva e incubare la camera umidificata dei vetrini per una o tre ore a 50 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, sostituire la soluzione di ibridazione con 250 microlitri di soluzione di sonda e coprire le diapositive con uno slittamento di copertura privo di RNasi. Cerca di evitare di intrappolare bolle d'aria sotto lo scivolo di copertura. Ora, sigillare attentamente la camera con il parafilm e incubare le diapositive durante la notte a circa 30 gradi Celsius al di sotto della temperatura di fusione dell'RNA della sonda.Potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione. Oltre a impostare la giusta temperatura di incubazione, vengono espresse diverse microRNA a diversi livelli, quindi può anche essere necessaria un'ottimizzazione per quanto riguarda la concentrazione della sonda per ottenere il segnale ottimale. Dopo l'ibridazione, eseguire i lavaggi di rigore.In primo luogo, è stato in 2x SSC a 50 gradi Celsius per cinque minuti, o fino a quando il coperchio scivola allentato. Quindi, eseguire due lavaggi in 2x SSC a temperatura ambiente, ciascuno per cinque minuti. Quindi, continuando a temperatura ambiente, lavare le diapositive per cinque minuti in 0,2x SSC, seguito da cinque minuti in PBST e, infine, cinque minuti in 1x PBS.A questo punto, gli ibridi RNA-RNA sono stabili e non sono più necessarie condizioni rigorose per l'RNA. Per il rilevamento degli anticorpi DIG, in primo luogo, ritoccare le barriere idrofobiche e applicare 500 microlitri di soluzione di blocco per trenta minuti. Incubare i vetrini a temperatura ambiente in una camera umidificata.Quindi, rimuovere la soluzione di blocco e sostituirla con 500 microlitri di soluzione anticorpale DIG. Incubare gli scivoli a temperatura ambiente in una camera umidificata per un'ora. Quindi, utilizzando i barattoli Coplin, lavare gli scivoli tre volte in PBST per cinque minuti per lavaggio.Quindi, lavare gli scivoli in soluzione di pre-colorazione per cinque minuti due volte. Quindi, trasferire le diapositive in un barattolo di mailer per diapositive in polipropilene e aggiungere 20 millilitri di soluzione di substrato AP. Ora, incubare le diapositive a 37 gradi Celsius per sei-24 ore, protette dalla luce.Quando si utilizza per la prima volta il substrato AP, è importante seguire la reazione. A intervalli di due ore, controllare lo sviluppo del colore sulle diapositive utilizzando un microscopio, fino a quando non è stato determinato un tempo di incubazione ottimale. Per rimuovere il substrato AP in eccesso, lavare le diapositive due volte in soluzione KTBT per cinque minuti per lavaggio, seguito da un lavaggio in PBS per cinque minuti.Per rilevare l'anticorpo cTNT, in primo luogo, bloccare i tessuti per un'ora. Quindi, applicare 200 microlitri di soluzione anticorpale cTNT e incubare i vetrini durante la notte a 4 gradi Celsius in una camera umidificata. Il giorno dopo, lavare gli scivoli in un barattolo coplin contenente PBS per cinque minuti.Fallo tre volte. Quindi, applicare 250 microlitri di soluzione anticorpale anti-coniglio 568 e incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente in una camera umidificata. Per lavare l'anticorpo secondario in eccesso, utilizzare tre lavaggi di cinque minuti in PBS.Quindi, se lo si desidera, applicare 250 microlitri di soluzione di lavoro DAPI e incubare le diapositive per un minuto, protette dalla luce. Per rimuovere la macchia DAPI in eccesso, utilizzare due lavaggi PBS di cinque minuti e, dopo i lavaggi, montare le diapositive. L'ibridazione microRNA in situ è stata ottimizzata sulle sezioni cardiache del mouse utilizzando un microRNA strapazzato per il controllo negativo e uno snRNA U6 come controllo positivo.L'espressione cardiomiocita-specifica del microRNA-182 è stata valutata in sezioni cardiache dal controllo e topi sovraespressivi plGF. I topi trasportavano un transgene PlGF sotto un promotore alfa-MHC, e svilupparono ipertrofia cardiaca, secondaria all'aumento dell'angiogenesi, entro sei settimane dall'attivazione del transgene. Il protocollo di colorazione ha rivelato una maggiore espressione di microRNA-182 nel cuore dei topi PlGF.Successivamente, per determinare quali tipi di cellule espresse microRNA-182, le stesse sezioni sono state immunostained per cTNT. È stata utilizzata anche la colorazione DAPI. Sia nelle sezioni del cuore del topo di controllo che in quello plGF, il microRNA-182 è stato trovato nel compartimento nucleare delle cellule cardiomiociti cTNT-positive.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'ibridazione microRNAse, seguita dall'immunosottenzione proteica. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante ricordare di mantenere le condizioni senza RNAse per tutto il primo giorno, durante tutti i passaggi che portano all'ibridazione di prop. Seguendo questa procedura, altri metodi come western blot in una PCR in tempo reale possono essere eseguiti per rispondere a domande come, quali sono i livelli di espressione relativa di questo particolare microRNA in diversi tessuti, o questa particolare proteina nella stessa sezione tissutale.Non dimenticare che lavorare con fissivi come PFA e ADC può essere estremamente pericoloso. Le precauzioni, tra cui indossare guanti e cappotti da laboratorio, nonché l'uso di cappe aspiranti, devono sempre essere prese quando si esegue questa procedura.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Genetica

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