Name: tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Athanasios Papangelis, for kritiske kommentarer på manuskriptet. FM støttes av bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP er støttet av den American Heart Association forsker Development Grant (17SDG33060002).

Musen hjertet vevsprøver for denne studien ble innhentet i henhold til relevante lover og institusjonelle retningslinjer og ble godkjent av Yale University institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
1. løsning forberedelse
<ol><li>Forberede RNase gratis ddH2O, ved å behandle 5 L ddH2O med 5 mL 0,1% diethylpyrocarbonate (DEPC) natten (O/N), ved romtemperatur (RT). Autoclave (121 ° C) for å deaktivere i DEPC. Bruk DEPC-behandlet ddH2O for utarbeidelse a...

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+primary+microRNAs+by+the+Microprocessor+complex.">Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex.</a> Nature. 432, 231-235 (2004).</li><li>Hutvagner, G., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+in+a+multiple-turnover+RNAi+enzyme+complex.">A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.</a> Science. 297, 2056-2060 (2002).</li><li>Krol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+microRNA+(miRNA)+precursors+and+their+relevance+to+miRNA+biogenesis+and+small+interfering+RNA/short+hairpin+RNA+design.">Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design.</a> Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).</li><li>Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+microRNA+genes.">Vertebrate microRNA genes.</a> Science. 299, 1540 (2003).</li><li>Tian, T., Wang, J., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+microRNA+detection+methods.">A review: microRNA detection methods.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).</li><li>Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+potentiate+neural+development.">MicroRNAs potentiate neural development.</a> Neuron. 64, 303-309 (2009).</li><li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).</li><li>Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-specific+MicroRNAs.">Embryonic stem cell-specific MicroRNAs.</a> Developmental cell. 5, 351-358 (2003).</li><li>Kasper, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Establish+Uniform+Traits+during+the+Architecture+of+Vertebrate+Embryos.">MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos.</a> Developmental cell. 40, 552-565 (2017).</li><li>Liu, N., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulatory+networks+in+cardiovascular+development.">MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development.</a> Developmental cell. 18, 510-525 (2010).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA+Interactome+in+Metabolic+Homeostasis.">The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).</li><li>Ying, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue+Macrophage-Derived+Exosomal+miRNAs+Can+Modulate+In+Vivo+and+In+Vitro+Insulin+Sensitivity.">Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.</a> Cell. 171, 372-384 (2017).</li><li>Perkins, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+expression+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia+and+schizoaffective+disorder.">microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder.</a> Genome biology. 8, R27 (2007).</li><li>Miller, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-132+dysregulation+in+schizophrenia+has+implications+for+both+neurodevelopment+and+adult+brain+function.">MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).</li><li>Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derepression+of+a+neuronal+inhibitor+due+to+miRNA+dysregulation+in+a+schizophrenia-related+microdeletion.">Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion.</a> Cell. 152, 262-275 (2013).</li><li>Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+psychiatric+disorders+with+a+focus+on+autism+spectrum+disorder:+Current+progress+in+genetic+association+studies,+expression+profiling,+and+translational+research.">MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research.</a> Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+microRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microRNA+expression+in+human+heart+disease.">Altered microRNA expression in human heart disease.</a> Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).</li><li>Mann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NF-kappaB-microRNA+regulatory+network+tunes+macrophage+inflammatory+responses.">An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses.</a> Nature Communications. 8, 851 (2017).</li><li>O'Connell, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+promotes+autoimmune+inflammation+by+enhancing+inflammatory+T+cell+development.">MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development.</a> Immunity. 33, 607-619 (2010).</li><li>Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+microRNAs:+from+subtype+profiling+to+predictors+of+response+to+therapy.">Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+component+of+the+p53+tumour+suppressor+network.">A microRNA component of the p53 tumour suppressor network.</a> Nature. 447, 1130-1134 (2007).</li><li>Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+microRNAs+in+animal+development+and+disease.">The diverse functions of microRNAs in animal development and disease.</a> Developmental cell. 11, 441-450 (2006).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-182+Modulates+Myocardial+Hypertrophic+Response+Induced+by+Angiogenesis+in+Heart.">miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart.</a> Science Reports. 6, 21228 (2016).</li><li>Meerson, F. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+hyperfunction+of+the+heart+and+cardiac+insufficiency.">Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency.</a> Circulation Research. 10, 250-258 (1962).</li><li>Tardiff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+hypertrophy:+stressing+out+the+heart.">Cardiac hypertrophy: stressing out the heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).</li><li>Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+ventricular+remodeling:+mechanisms:+part+1+of+2.">Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2.</a> Circulation. 128, 388-400 (2013).</li><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146-e603 (2017).</li><li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues.">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nature Methods. 6, 139-141 (2009).</li></ol>

miRNA transkripsjon gjenkjenning kan oppnås gjennom forskjellige teknikker som varierer i sensitivitet og spesifisitet kvantitative makt. Her viser vi koblingen av miRNA i situ hybridisering med immunostai- og beskrive en protokoll som tillater samtidig vurdering av uttrykket miRNA og protein molekyler, på samme hjertet seksjoner. Først viser vi hvordan du utfører i situ hybridisering av grave-merket LNA miRNA sonder på innebygd hjertet parafinsnitt. Deretter beskriver vi hvordan å utføre immunos...

mikro-RNAs (miRNAs) er kort (18-25 nukleotider), enkelt-strandet, noncoding RNAs som fungerer som negative regulatorer av genuttrykk på post-transcriptional nivå av hemme budbringer RNA (mRNA) oversettelse og/eller fremme mRNA degradering 1. miRNAs er transkribert fra introns eller exons koding eller noncoding gener og er kløyvde i kjernen av DROSHA, til forløperen miRNAs (pre-miRNAs), som er kort stilk-sløyfe strukturer av 70 nukleotider2. Etter cytoplasmatiske eksportere, pre-miRNAs behandles videre av DICER i eldre miRNAs som spenner over 18-25 nukleotider3,4. Deretter omfatter RNA-indusert stanse komplekset (RISC) disse miRNAs som enkelt-strandet RNAs, som tillater for deres tilknytning til 3 uoversatt regionen (3-UTR) deres mål mRNAs å undertrykke deres uttrykk3,5 .
I de siste tre tiårene, siden de ble først identifisert, miRNAs har dukket opp til master regulatorer av genuttrykk, som selv uttrykk er strengt kontrollert6. Roller for miRNAs er beskrevet i orgel utvikling7,8,9,10,11,12, vedlikehold av homeostase13,14 , samt sykdom sammenhenger med nevrologiske15,16,17,18,19, hjerte20, autoimmune tilstander21 ,22, kreft23,24og andre25. Den økende forståelse for relevansen av miRNA uttrykk mønstre har brakt frem behovet for pålitelig gjenkjenningsmetoder av miRNA transkripsjoner. Slike metoder omfatter sanntid PCR, microarrays, nordlige Blotting, i situ hybridisering og andre, som varierer i følsomhet, spesifisitet og kvantitative makt, hovedsakelig på grunn av at miRNA transkripsjoner består av kort og svært homologe sekvenser6.
Vi har nylig rapportert en viktig rolle for miRNA-182 i utviklingen av hjerteinfarkt hypertrofi26, en tilstand som beskriver strukturell tilpasning av hjertet svar til forhøyet hemodynamic krav27,28. Hjerte-hypertrofi er preget av økningen i hjerteinfarkt masse, som, hvis knyttet mistilpasset remodeling29, kan føre til økt risiko for hjertesvikt, en tilstand regnskap for 8,5% av alle dødsfall skyldes hjerte sykdom30.
Her beskriver vi våre protokollen som kombinerer i situ hybridisering med digoxigenin-merket (graver) låst Nucleic Acid (LNA) sonde og immunostai-for samtidige påvisning av miRNA og protein molekyler på musen hjertet vev deler, i våre modell av hjerte-hypertrofi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>DEPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02038</td>
			<td>non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>ProK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 1 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 12 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methylimidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>336092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>39391</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td>H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Sodium Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>339450</td>
			<td>scramble miRNA/U6 snRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>YD00615701</td>
			<td>5&#39;-DIG and 3&#39;-DIG labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisol hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT/BCIP Tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11697471001</td>
			<td>NBT-BCIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P217</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic coverslip</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td>
			<td>RNA-ase free plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>DIG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Pap pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td>cTnT antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>anti-rabbit-568 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Formamide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>UVP HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization

mikro-RNAs (miRNAs) er enkelt-strandet RNA utskrifter som binder til messenger RNAs (mRNAs) og hemme deres oversettelse eller fremme deres degradering. Hittil har miRNAs vært innblandet i en rekke biologiske og sykdom prosesser, som har markert behovet for pålitelig gjenkjenningsmetoder for miRNA transkripsjoner. Her beskriver vi en detaljert protokoll for digoxigenin-merket (graver) låst Nucleic Acid (LNA) probe-baserte miRNA oppdagelsen, kombinert med protein immunostaining på musen hjertet deler. Først utført vi en i situ hybridisering teknikk ved hjelp av sonden for å identifisere miRNA-182 uttrykk i hjertet delene av kontroll og hjerte-hypertrofi mus. Neste, vi utført immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, på i samme avsnitt, å lokalisere co miRNA-182 med cardiomyocyte celler. Bruker denne protokollen, kunne vi oppdage miRNA-182 gjennom en alkalisk fosfatase basert kolorimetrisk analysen, og cTnT gjennom fluorescerende flekker. Denne protokollen kan brukes til å oppdage uttrykk for alle miRNA rundt gjennom grave-merket LNA sonder, og relevante protein uttrykk på musen hjertet vev deler.

miRNA i situ hybridisering var optimalisert på musen hjertet deler bruker scramble miRNA og U6-snRNA, som fungerte som negative og positive kontroller henholdsvis. Positiv flekker er angitt i blå, mens den negative flekker er angitt for farge utvikling (figur 1A-1B). Cardiomyocyte bestemte uttrykk for miRNA-182 ble vurdert i hjertet deler av kontroll og PlGF overexpressing mus. Mus bærer PlGF transgene under en αMHC promoter utvi...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Vev-spesifikke miRNA Expression profilering i musen hjertet delene bruke In Situ hybridisering

mikro-RNAs (miRNAs) er korte og svært homologe RNA sekvenser, som post-transcriptional regulatorer av messenger RNAs (mRNAs). Gjeldende miRNA gjenkjenningsmetoder varierer i sensitivitet og spesifisitet. Vi beskriver en protokoll som kombinerer i situ hybridisering og immunostai-samtidige deteksjon av miRNA og protein molekyler på musen hjertet vev deler.

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i microRNA-feltet, ved å gi verktøy for å oppdage den relative lcalization av både protein og microRNA molekyler. Den største fordelen med denne teknikken er at du kan oppdage både protein- og microRNA-molekyler fra samme vevsseksjon. Denne protokollen begynner med en rehydrering av det lysbildemonterte vevet.Varm lysbildene ved 60 grader Celsius i 10 minutter i hybridiseringsovnen. Parafinen skal være synlig smelting. Deretter inkuber lysbildene i en glass Coplin krukke som inneholder kommersielt tilgjengelig clearing agent i 10 minutter.Gjør dette to ganger. Deretter overfører lysbildene fra vask til vask for å rehydrere vevet. Når hydrert, inkuber vevet i proteinase K arbeidsløsning ved 37 grader Celsius i 15 minutter.For å fjerne proteinase K, vask lysbildene i 1x PBS to ganger. Nå, fikse vevet. Først lager du reservoarer på lysbildene ved hjelp av en hydrofob penn for å tegne en vannavstøtende sirkel rundt preparatene.Deretter påfør 500 mikroliter med 4% PFA-løsning innenfor barrieren, og inkuber lysbildene i en røykhette. For å fjerne fikseringen, vask lysbildene i en Coplin-krukke som inneholder PBS i fem minutter to ganger ved romtemperatur. Deretter vasker lysbildene i 0,13 molar 1-Methylimidazol i 10 minutter.Gjør dette i røykhetten ved romtemperatur, og utfør denne vasken to ganger. Tilsett EDC-fikseringen, og inkuber ved romtemperatur i en røykhette i en time. Skyll av lysbildene med 50-millimolar Tris.For å forberede hybridiseringen, først bygge et fuktet kammer. Legg to stykker filter eller vevpapir i bunnen av en boks, og våt papiret med en en-til-en-blanding av formamid og 1x SSC. Deretter bruker du 200 mikroliter med forhåndsoppvarmet hybridiseringsløsning på hvert lysbilde, og inkuberer det fuktede skyvekammeret i en til tre timer ved 50 grader Celsius.Etter inkubasjonen erstatter du hybridiseringsløsningen med 250 mikroliter probeløsning, og dekker lysbildene med en RNase-fri dekselslipp. Prøv å unngå å fange luftbobler under dekselet slip. Nå forsegler du forsiktig kammeret med parafilm, og inkuber lysbildene over natten på ca. 30 grader Celsius under RNA-smeltetemperaturen til sonden.Optimalisering kan være nødvendig. I tillegg til å stille inn riktig inkubasjonstemperatur, uttrykkes forskjellige microRNAer på forskjellige nivåer, så optimalisering av sondekonsentrasjonen kan også være nødvendig for å få det optimale signalet. Etter hybridiseringen utfører du stringency vasker.Først var i 2x SSC ved 50 grader Celsius i fem minutter, eller til dekselet glir løsne. Deretter utfører du to vasker i 2x SSC ved romtemperatur, hver i fem minutter. Deretter fortsetter ved romtemperatur, vask lysbildene i fem minutter i 0,2x SSC, etterfulgt av fem minutter i PBST, og til slutt fem minutter i 1x PBS.På dette punktet er RNA-RNA hybrider stabile, og RNA-strenge forhold er ikke lenger nødvendig. For DIG antistoffdeteksjon, først, ta opp hydrofobe barrierer, og påfør 500 mikroliter med blokkeringsløsning i tretti minutter. Inkuber lysbildene ved romtemperatur i et fuktet kammer.Deretter fjerner du blokkeringsløsningen og erstatter den med 500 mikroliter DIG antistoffoppløsning. Inkuber lysbildene ved romtemperatur i et fuktet kammer i en time. Deretter, ved hjelp av Coplin krukker, vaske lysbildene tre ganger i PBST i fem minutter per vask.Vask deretter lysbildene i pre-farging løsning i fem minutter to ganger. Deretter overfører du lysbildene til en polypropylenlyseutsenderkrukke, og legger til 20 milliliter AP-substratløsning. Nå inkuber lysbildene ved 37 grader Celsius i seks til 24 timer, beskyttet mot lyset.Når du først bruker AP-substrat, er det viktig å følge reaksjonen. På to timers intervaller kontrollerer du fargeutviklingen på lysbildene ved hjelp av et mikroskop, til en optimal inkubasjonstid er bestemt. For å fjerne overflødig AP-substrat, vask lysbildene to ganger i KTBT-oppløsning i fem minutter per vask, etterfulgt av en vask i PBS i fem minutter.For å oppdage cTNT-antistoffet, må du først blokkere vevet i en time. Deretter påfør 200 mikroliter cTNT antistoffløsning, og inkuber lysbildene over natten ved 4 grader Celsius i et fuktet kammer. Neste dag vasker du lysbildene i en Coplin-krukke som inneholder PBS i fem minutter.Gjør dette tre ganger. Deretter påfør 250 mikroliter antikanin 568 antistoffløsning, og inkuber lysbildene i en time ved romtemperatur i et fuktet kammer. For å vaske ut overflødig sekundært antistoff, bruk tre fem minutters vasker i PBS.Deretter, om ønskelig, bruk 250 mikroliter dapi arbeidsløsning, og inkuber lysbildene i ett minutt, beskyttet mot lys. Hvis du vil fjerne overflødig DAPI-flekk, bruker du to fem minutters PBS-vasker, og etter vaskene monterer du lysbildene. MicroRNA in-situ hybridisering ble optimalisert på mus hjerte seksjoner ved hjelp av en kryptert microRNA for negativ kontroll, og en U6 snRNA som en positiv kontroll.Kardiomyocyttspesifikt uttrykk for microRNA-182 ble vurdert i hjerteseksjoner fra kontroll og PlGF-overuttrykkende mus. Musene bar en PlGF transgene under en alfa-MHC promotor, og utviklet hjertehypertrofi, sekundært til økt angiogenese, innen seks uker etter transgen aktivering. Fargeprotokollen avslørte økt uttrykk for microRNA-182 i hjertene til PlGF-mus.Deretter, for å finne ut hvilke celletyper uttrykt microRNA-182, ble de samme delene immunostained for cTNT. DAPI farging ble også brukt. I både kontroll og PlGF mus hjerte seksjoner, microRNA-182 ble funnet i kjernefysiske rommet av cTNT-positive kardiomyocytt celler.Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du utfører microRNAse hybridisering, etterfulgt av proteinimmunostaining. Mens du prøver denne prosedyren, er det svært viktig å huske å holde RNAse-frie forhold hele dag én, under alle trinnene som fører opp til prop hybridisering. Etter denne prosedyren kan andre metoder som vestlig flekk i sanntid PCR utføres for å svare på spørsmål som, hva er de relative uttrykksnivåene til denne spesielle microRNA i forskjellige vev, eller dette spesielle proteinet i samme vevseksjon.Ikke glem at det kan være ekstremt farlig å arbeide med fikseringsmidler som PFA og ADC. Forholdsregler, inkluderer bruk hansker og lab strøk, samt bruk av røyk hetter, bør alltid tas når du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Merking av mitokondriell DNA replikasjon i Drosophila voksen Eggstokkene Edu Farging

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Måling av biologiske klokke genekspresjon og hormon i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenese Bruke Histone-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Påvisning av Inter-kromosom Stabil Avvik ved Multiple fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) og Spectral karyotypering (SKY) i Bestrålet Mus

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikering Timing bruker sebrafisk som en In Vivo modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick Guts av hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Ett molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyse i spirende gjær vegetativ vekst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...