Name: tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Атанасиоса Papangelis, за критические замечания по рукописи. FM поддерживается биотехнологии и биологических наук научно-исследовательский совет (СИББН; BB/M009424/1). IP поддерживается грант развития ассоциации ученый американского сердца (17SDG33060002).

Образцы тканей сердца мыши для этого исследования были получены согласно соответствующим законам и институциональных руководящих принципов и были одобрены Йельского университета институциональных животное уход и использование Комитета.
1. решение подготовка
<ol><li>По?...

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+primary+microRNAs+by+the+Microprocessor+complex.">Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex.</a> Nature. 432, 231-235 (2004).</li><li>Hutvagner, G., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+in+a+multiple-turnover+RNAi+enzyme+complex.">A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.</a> Science. 297, 2056-2060 (2002).</li><li>Krol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+microRNA+(miRNA)+precursors+and+their+relevance+to+miRNA+biogenesis+and+small+interfering+RNA/short+hairpin+RNA+design.">Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design.</a> Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).</li><li>Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+microRNA+genes.">Vertebrate microRNA genes.</a> Science. 299, 1540 (2003).</li><li>Tian, T., Wang, J., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+microRNA+detection+methods.">A review: microRNA detection methods.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).</li><li>Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+potentiate+neural+development.">MicroRNAs potentiate neural development.</a> Neuron. 64, 303-309 (2009).</li><li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).</li><li>Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-specific+MicroRNAs.">Embryonic stem cell-specific MicroRNAs.</a> Developmental cell. 5, 351-358 (2003).</li><li>Kasper, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Establish+Uniform+Traits+during+the+Architecture+of+Vertebrate+Embryos.">MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos.</a> Developmental cell. 40, 552-565 (2017).</li><li>Liu, N., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulatory+networks+in+cardiovascular+development.">MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development.</a> Developmental cell. 18, 510-525 (2010).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA+Interactome+in+Metabolic+Homeostasis.">The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).</li><li>Ying, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue+Macrophage-Derived+Exosomal+miRNAs+Can+Modulate+In+Vivo+and+In+Vitro+Insulin+Sensitivity.">Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.</a> Cell. 171, 372-384 (2017).</li><li>Perkins, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+expression+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia+and+schizoaffective+disorder.">microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder.</a> Genome biology. 8, R27 (2007).</li><li>Miller, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-132+dysregulation+in+schizophrenia+has+implications+for+both+neurodevelopment+and+adult+brain+function.">MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).</li><li>Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derepression+of+a+neuronal+inhibitor+due+to+miRNA+dysregulation+in+a+schizophrenia-related+microdeletion.">Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion.</a> Cell. 152, 262-275 (2013).</li><li>Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+psychiatric+disorders+with+a+focus+on+autism+spectrum+disorder:+Current+progress+in+genetic+association+studies,+expression+profiling,+and+translational+research.">MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research.</a> Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+microRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microRNA+expression+in+human+heart+disease.">Altered microRNA expression in human heart disease.</a> Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).</li><li>Mann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NF-kappaB-microRNA+regulatory+network+tunes+macrophage+inflammatory+responses.">An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses.</a> Nature Communications. 8, 851 (2017).</li><li>O'Connell, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+promotes+autoimmune+inflammation+by+enhancing+inflammatory+T+cell+development.">MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development.</a> Immunity. 33, 607-619 (2010).</li><li>Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+microRNAs:+from+subtype+profiling+to+predictors+of+response+to+therapy.">Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+component+of+the+p53+tumour+suppressor+network.">A microRNA component of the p53 tumour suppressor network.</a> Nature. 447, 1130-1134 (2007).</li><li>Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+microRNAs+in+animal+development+and+disease.">The diverse functions of microRNAs in animal development and disease.</a> Developmental cell. 11, 441-450 (2006).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-182+Modulates+Myocardial+Hypertrophic+Response+Induced+by+Angiogenesis+in+Heart.">miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart.</a> Science Reports. 6, 21228 (2016).</li><li>Meerson, F. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+hyperfunction+of+the+heart+and+cardiac+insufficiency.">Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency.</a> Circulation Research. 10, 250-258 (1962).</li><li>Tardiff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+hypertrophy:+stressing+out+the+heart.">Cardiac hypertrophy: stressing out the heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).</li><li>Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+ventricular+remodeling:+mechanisms:+part+1+of+2.">Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2.</a> Circulation. 128, 388-400 (2013).</li><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146-e603 (2017).</li><li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues.">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nature Methods. 6, 139-141 (2009).</li></ol>

Мирна Стенограмма обнаружения может быть достигнуто через различные методы, которые варьируются в чувствительность, специфичность и количественные власти. Здесь, мы демонстрируем муфта микроРНК в situ гибридизация с иммуноокрашивания и описать протокол, который позволяет для пар?...

микро РНК (интерферирующим) являются короткие (18-25 нуклеотидов), одноцепочечной, некодирующей РНК, которые функционируют как негативные регуляторы экспрессии генов на post-transcriptional уровне путем ингибирования матричная РНК (мРНК) перевод и/или содействия деградации мРНК 1. интерферирующим расшифрованный от интронов или экзонов кодирования или некодирующей генов и являются расщепляется в ядре, DROSHA, чтобы прекурсоров интерферирующим (pre адаптивной), которые являются короткий стебель циклические структуры 70 нуклеотидов2. После цитоплазматических экспорта, pre адаптивной Далее перерабатывается DICER в зрелых адаптивной, которые охватывают 18-25 нуклеотидов3,4. Впоследствии РНК-комплекс (RISC) включает в себя эти интерферирующим как одноцепочечной РНК, которая позволяет для их привязки к 3' непереведенные региона (3'-УТР) их целевых мРНК подавить их выражение3,5 .
В течение последних трех десятилетий так как они впервые были определены, адаптивной появились мастер регуляторы экспрессии генов, чьи собственные уровни выражения являются жестко контролируемой6. Роли для адаптивной были описаны в орган развития7,8,9,10,11,12, поддержание гомеостаза13,14 , а также болезни контексты, которые включают неврологические15,16,,1718,19, сердечно-20, аутоиммунных условия21 ,22, рака23,24и другие25. Увеличение признательность за актуальность структур Мирна выражение выдвинули необходимость надежного обнаружения методов Мирна стенограмм. Такие методы включают реальном масштабе времени PCR, microarrays, Северный Blotting, в situ Гибридизация и другие, которые различаются в чувствительность, специфичность и количественные власти, преимущественно с тем, что Мирна стенограммы состоят из коротких и 6высоко гомологичных последовательности.
Недавно мы сообщили важную роль для Мирна-182 в развитие гипертрофии миокарда26, условие, описывая структурной адаптации сердца в ответ на повышенный гемодинамики требования27,28. Гипертрофии сердца характерно увеличение массы миокарда, который, если связанные с неадаптивные ремоделирования29, может привести к повышенному риску развития сердечной недостаточности, условие, приходится 8,5% всех смертей объясняется сердечно-сосудистой системы болезни30.
Здесь мы описываем наш протокол, который сочетает в себе в situ гибридизация с надписью digoxigenin (DIG) Locked нуклеиновой кислоты (LNA) зонд и иммуноокрашивания для одновременного обнаружения Мирна и белковых молекул на разделах ткани сердца мыши, в нашем модель гипертрофии сердца.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>DEPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02038</td>
			<td>non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>ProK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 1 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 12 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methylimidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>336092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>39391</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td>H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Sodium Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>339450</td>
			<td>scramble miRNA/U6 snRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>YD00615701</td>
			<td>5&#39;-DIG and 3&#39;-DIG labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisol hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT/BCIP Tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11697471001</td>
			<td>NBT-BCIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P217</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic coverslip</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td>
			<td>RNA-ase free plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>DIG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Pap pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td>cTnT antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>anti-rabbit-568 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Formamide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>UVP HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization

микро РНК (интерферирующим) являются одноцепочечной РНК стенограмм, которые привязку к messenger РНК (мРНК) и препятствовать их перевода или содействовать их деградации. На сегодняшний день, адаптивной были причастны большое количество болезней и биологических процессов, который означало необходимость надежного обнаружения методов Мирна стенограмм. Здесь мы описываем подробный протокол для digoxigenin меченых (DIG) Locked нуклеиновой кислоты (LNA) на основе выборки Мирна обнаружения, в сочетании с иммуноокрашивания белка на мыши сердце секций. Во-первых мы провели в situ гибридизация технику с помощью зонда для определения Мирна-182 выражение в разделах сердца от управления и гипертрофии сердца мышей. Далее мы провели иммуноокрашивания для сердца тропонина T (cTnT) белка, на те же разделы, совместно локализовать Мирна-182 с клетки cardiomyocyte. Используя этот протокол, мы смогли обнаружить основанный Мирна-182 через щелочной фосфатазы колориметрические пробирного и cTnT через флуоресцентной окраски. Этот протокол может использоваться для обнаружения выражение любого Мирна интерес через DIG-меченых LNA зонды и соответствующих белков на разделах ткани сердца мыши.

микроРНК в situ гибридизация была оптимизирована на мыши сердце разделов с помощью схватка Мирна и U6-мяРНК, который служил в качестве отрицательных и положительных элементов, соответственно. Положительный пятнать указывается в синий, в то время как негативные пятн...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации In Situ

микро РНК (интерферирующим) являются короткие и очень гомологичных последовательности РНК, выступающей в качестве post-transcriptional регуляторы messenger РНК (мРНК). Текущие методы обнаружения Мирна различаются по чувствительности и специфичности. Мы описываем протокол, который сочетает в себе в situ Гибридизация и иммуноокрашивания для одновременного обнаружения Мирна и белковых молекул на разделах ткани сердца мыши.

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроРНК, предоставляя инструменты для обнаружения относительной икализации молекул белка и микроРНК. Основным преимуществом этой техники является то, что вы можете обнаружить как белок и молекулы микроРНК из той же части ткани. Этот протокол начинается с регидратации тканей, установленных на слайдах.Разогрейте горки при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 10 минут в духовке гибридизации. Парафин должен заметно таять. Затем инкубировать слайды в стеклянной банке Coplin, содержащей коммерчески доступный клиринговый агент в течение 10 минут.Сделай это дважды. Затем перенесите слайды с мытья на стирку для регидратации тканей. После увлажнения, инкубировать ткани в proteinase K рабочий раствор при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут.Чтобы удалить протеиназу K, мыть слайды в 1x PBS два раза. Теперь почини ткани. Во-первых, сделать резервуары на слайдах с помощью гидрофобной ручкой, чтобы нарисовать водоотталкивающий круг вокруг препаратов.Затем нанесите 500 микролитров раствора 4%PFA в пределах барьера и инкубировать горки в дымовой капот. Чтобы удалить фиксатор, мыть горки в банке Coplin содержащие PBS в течение пяти минут два раза при комнатной температуре. Затем промойте горки в 0,13 моляра 1-метилимидазола в течение 10 минут.Сделайте это в дымовой капот при комнатной температуре, и выполнить эту стирку в два раза. Добавить EDC фиксации, и инкубировать при комнатной температуре в дым капот в течение одного часа. Смойте горки 50-миллимолярной трис.Чтобы подготовиться к гибридизации, сначала постройте увлажненные камеры. Загрузите два куска фильтра или бумаги в нижней части коробки, и мокрой бумаги с один-к-одному смесь формамида и 1x SSC. Затем нанесите 200 микролитров предварительно разогретого раствора гибридизации на каждый слайд и инкубировать увлажненной камерой слайдов в течение одного-трех часов при 50 градусах Цельсия.После инкубации замените раствор гибридизации на 250 микролитров раствора зонда и накройте слайды крышкой без RNase. Старайтесь избегать захвата пузырьков воздуха под крышкой скольжения. Теперь, тщательно запечатать камеру с парафильмом, и инкубировать слайды ночь примерно на 30 градусов по Цельсию ниже температуры плавления РНК зонда.Может потребоваться оптимизация. В дополнение к установлению правильной температуры инкубации, различные микроРНК выражаются на разных уровнях, поэтому для достижения оптимального сигнала может потребоваться оптимизация концентрации зонда. После гибридизации, выполнить стренитность моет.Во-первых, был в 2x SSC при 50 градусах по Цельсию в течение пяти минут, или до тех пор, пока крышка скользит ослабить. Затем выполните две стирки в 2x SSC при комнатной температуре, каждая в течение пяти минут. Затем, продолжая при комнатной температуре, мыть горки в течение пяти минут в 0,2x SSC, а затем пять минут в PBST, и, наконец, пять минут в 1x PBS.На данный момент гибриды РНК-РНК стабильны, и условия, жесткие по РНК, больше не нужны. Для обнаружения антител DIG, во-первых, прикоснуться к гидрофобных барьеров, и применить 500 микролитров блокирующего раствора в течение тридцати минут. Инкубировать горки при комнатной температуре в увлажненной камере.Затем удалите блокирующий раствор и замените его 500 микролитров раствора антител DIG. Инкубировать горки при комнатной температуре во влажной камере в течение часа. Затем, используя банки Coplin, мыть слайды три раза в PBST в течение пяти минут за стирку.Затем дважды промойте слайды в растворе для предварительного окрашивания в течение пяти минут. Затем перенесите слайды в банку с полипропиленом слайд-почтальоном и добавьте 20 миллилитров субстратного раствора AP. Теперь инкубировать горки при 37 градусах по Цельсию в течение шести-24 часов, защищенных от света.При первом использовании субстрата AP важно следить за реакцией. На двухчасовых интервалах проверьте развитие цвета на слайдах с помощью микроскопа, пока не будет определено оптимальное время инкубации. Чтобы удалить избыток субстрата AP, мыть горки дважды в растворе KTBT в течение пяти минут за стирку, а затем один мыть в PBS в течение пяти минут.Чтобы обнаружить антитела cTNT, во-первых, блокировать ткани в течение часа. Затем нанесите 200 микролитров раствора антител cTNT и инкубировать горки на ночь при 4 градусах по Цельсию во влажной камере. На следующий день, мыть слайды в банке Коплин, содержащий PBS в течение пяти минут.Сделай это три раза. Затем нанесите 250 микролитров анти-кролика 568 антитела раствора, и инкубировать слайды в течение часа при комнатной температуре в увлажненной камере. Чтобы вымыть избыток вторичного антитела, используйте три пятиминутных моет в PBS.Затем, при желании, нанесите 250 микролитров рабочего решения DAPI и инкубировать горки на одну минуту, защищенные от света. Чтобы удалить избыток пятна DAPI, используйте две пятиминутные стирки PBS, а после стирки, смонтировать слайды. Гибридизация microRNA in-situ была оптимизирована на секциях сердца мыши с помощью скремблированной микроРНК для отрицательного контроля и SnRNA U6 в качестве положительного контроля.Кардиомиоцит-специфическое выражение микроРНК-182 оценивалось в сердечных секциях от контроля и PlGF-переэкспрессии мышей. Мыши несли трансген PlGF под альфа-MHC промоутер, и разработали сердечной гипертрофии, вторичной по отношению к увеличению ангиогенеза, в течение шести недель трансгенной активации. Протокол окрашивания выявил повышенную экспрессию микроРНК-182 в сердцах мышей PlGF.Далее, чтобы определить, какие типы клеток выражают микроРНК-182, те же участки были иммунотелены для CTNT. Также использовалось окрашивание DAPI. В обоих контрольных и PlGF мыши сердца разделов, микроРНК-182 был найден в ядерном отсеке CTNT-положительных клеток кардиомиоцитов.После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как выполнить микроРНАЗ гибридизации, а затем белка иммуностимунизации. При попытке этой процедуры, очень важно помнить, чтобы сохранить RNAse свободных условиях в течение первого дня, во время всех шагов, ведущих к поддержке гибридизации. После этой процедуры, другие методы, такие как западная помарка в режиме реального времени ПЦР может быть выполнена, чтобы ответить на вопросы, как, каковы относительные уровни экспрессии этой конкретной микроРНК в различных тканях, или этот конкретный белок в той же части ткани.Не забывайте, что работа с фиксаторами, такими как PFA и ADC, может быть чрезвычайно опасной. Меры предосторожности, в том числе носить перчатки и лабораторные пальто, а также с помощью дыма капюшоны, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

В Ситу маркировки репликации митохондриальной ДНК в Drosophila взрослых яичников с помощью EDU Окрашивание

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Обнаружение Inter-хромосомных аберраций Стабильные многократными флюоресценции<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация (mFISH) и спектральное кариотипирование (SKY) в облученных мышей

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Одноклеточный экспрессии генов профилирование с помощью FACS и КПЦР с внутренними стандартами

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Профилирования времени репликации ДНК, используя данио рерио как в естественных условиях модель системы

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Визуализация микробиоты в кишки клеща в целом гора в Situ гибридизация

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...