Name: tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Vi vill tacka Athanasios Papangelis, för kritiska synpunkter på manuskriptet. FM stöds av bioteknik och biologiska Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP stöds av amerikanska hjärtat Association vetenskapsman utveckling bidraget (17SDG33060002).

Mus hjärtat vävnadsprover för denna studie erhölls i enlighet med relevanta lagar och institutionella riktlinjer och godkändes av Yale University institutionella djur vård och användning kommittén.
1. lösningen förberedelse
<ol><li>Förbereda RNase gratis ddH2O, genom att behandla 5 L ddH2O 5 ml 0,1% diethylpyrocarbonate (DEPC) över natten (O/N), vid rumstemperatur (RT). Autoklav (121 ° C) för att avaktivera DEPC. Användning DEPC-behandlad ddH2O...

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+primary+microRNAs+by+the+Microprocessor+complex.">Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex.</a> Nature. 432, 231-235 (2004).</li><li>Hutvagner, G., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+in+a+multiple-turnover+RNAi+enzyme+complex.">A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.</a> Science. 297, 2056-2060 (2002).</li><li>Krol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+microRNA+(miRNA)+precursors+and+their+relevance+to+miRNA+biogenesis+and+small+interfering+RNA/short+hairpin+RNA+design.">Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design.</a> Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).</li><li>Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+microRNA+genes.">Vertebrate microRNA genes.</a> Science. 299, 1540 (2003).</li><li>Tian, T., Wang, J., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+microRNA+detection+methods.">A review: microRNA detection methods.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).</li><li>Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+potentiate+neural+development.">MicroRNAs potentiate neural development.</a> Neuron. 64, 303-309 (2009).</li><li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).</li><li>Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-specific+MicroRNAs.">Embryonic stem cell-specific MicroRNAs.</a> Developmental cell. 5, 351-358 (2003).</li><li>Kasper, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Establish+Uniform+Traits+during+the+Architecture+of+Vertebrate+Embryos.">MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos.</a> Developmental cell. 40, 552-565 (2017).</li><li>Liu, N., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulatory+networks+in+cardiovascular+development.">MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development.</a> Developmental cell. 18, 510-525 (2010).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA+Interactome+in+Metabolic+Homeostasis.">The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).</li><li>Ying, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue+Macrophage-Derived+Exosomal+miRNAs+Can+Modulate+In+Vivo+and+In+Vitro+Insulin+Sensitivity.">Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.</a> Cell. 171, 372-384 (2017).</li><li>Perkins, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+expression+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia+and+schizoaffective+disorder.">microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder.</a> Genome biology. 8, R27 (2007).</li><li>Miller, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-132+dysregulation+in+schizophrenia+has+implications+for+both+neurodevelopment+and+adult+brain+function.">MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).</li><li>Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derepression+of+a+neuronal+inhibitor+due+to+miRNA+dysregulation+in+a+schizophrenia-related+microdeletion.">Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion.</a> Cell. 152, 262-275 (2013).</li><li>Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+psychiatric+disorders+with+a+focus+on+autism+spectrum+disorder:+Current+progress+in+genetic+association+studies,+expression+profiling,+and+translational+research.">MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research.</a> Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+microRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microRNA+expression+in+human+heart+disease.">Altered microRNA expression in human heart disease.</a> Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).</li><li>Mann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NF-kappaB-microRNA+regulatory+network+tunes+macrophage+inflammatory+responses.">An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses.</a> Nature Communications. 8, 851 (2017).</li><li>O'Connell, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+promotes+autoimmune+inflammation+by+enhancing+inflammatory+T+cell+development.">MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development.</a> Immunity. 33, 607-619 (2010).</li><li>Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+microRNAs:+from+subtype+profiling+to+predictors+of+response+to+therapy.">Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+component+of+the+p53+tumour+suppressor+network.">A microRNA component of the p53 tumour suppressor network.</a> Nature. 447, 1130-1134 (2007).</li><li>Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+microRNAs+in+animal+development+and+disease.">The diverse functions of microRNAs in animal development and disease.</a> Developmental cell. 11, 441-450 (2006).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-182+Modulates+Myocardial+Hypertrophic+Response+Induced+by+Angiogenesis+in+Heart.">miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart.</a> Science Reports. 6, 21228 (2016).</li><li>Meerson, F. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+hyperfunction+of+the+heart+and+cardiac+insufficiency.">Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency.</a> Circulation Research. 10, 250-258 (1962).</li><li>Tardiff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+hypertrophy:+stressing+out+the+heart.">Cardiac hypertrophy: stressing out the heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).</li><li>Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+ventricular+remodeling:+mechanisms:+part+1+of+2.">Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2.</a> Circulation. 128, 388-400 (2013).</li><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146-e603 (2017).</li><li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues.">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nature Methods. 6, 139-141 (2009).</li></ol>

miRNA avskrift upptäckt kan uppnås genom olika tekniker som varierar i känslighet, specificitet och kvantitativa makt. Här visar vi kopplingen av miRNA i situ hybridisering med immunfärgning och beskriva ett protokoll som möjliggör samtidiga bedömningen av de uttryck av miRNA och protein molekyler, på avsnitten samma hjärta. Vi visar först hur du utför i situ hybridisering av gräva-märkt LNA miRNA sonder på paraffin inbäddade hjärtat sektioner. Därefter beskriver vi hur du utför immun...

Micro-RNAs (Mirna) är kort (18 – 25 nukleotider), enkelsträngat, icke-kodande RNAs som fungerar som negativa regulatorer av genuttryck på post-transcriptional nivå genom att hämma budbärar-RNA (mRNA) översättning och/eller främja mRNA nedbrytning 1. MicroRNA transkriberas från introner eller exoner kodning eller icke-kodande gener och är klyvs i kärnan av DROSHA, till föregångare MicroRNA (pre-MicroRNA), som är kort stam-loop strukturer av 70 nukleotider2. Efter cytoplasmiska export, pre-MicroRNA är bearbetas vidare av DICER till mogen MicroRNA som spänner över 18 – 25 nukleotider3,4. Därefter införlivar RNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplexet (RISC) dessa MicroRNA som enkelsträngat RNA, vilket möjliggör deras bindning till 3' oöversatta regionen (3'-UTR) i deras mål mRNA att undertrycka sin expression3,5 .
Inom de senaste tre decennierna, eftersom de identifierades först, har MicroRNA framkommit att master regulatorer av genuttryck, vars egna uttryck nivåer är väl kontrollerad6. Roller för MicroRNA har beskrivits i orgel utveckling7,8,9,10,11,12, underhåll av homeostas13,14 , liksom sjukdom sammanhang som inkluderar neurologiska15,16,17,18,19, kardiovaskulära20, autoimmuna tillstånd21 ,22, cancer23,24och andra25. Den ökande uppskattning för relevansen av miRNA uttrycksmönster har fört fram behovet av tillförlitlig upptäckt metoder för miRNA avskrifter. Sådana metoder inkluderar realtid PCR, microarrays, Northern Blotting, i situ hybridisering och andra, som varierar i känslighet, specificitet och kvantitativa makt, huvudsakligen på grund av att miRNA avskrifter består av korta och Mycket homologa sekvenser6.
Vi rapporterade nyligen en viktig roll för miRNA-182 i utvecklingen av den myokardiella hypertrofi26, ett villkor som beskriver den strukturella anpassningen av hjärtat som svar på förhöjda hemodynamiska krav27,28. Hjärthypertrofi kännetecknas av ökningen i den hjärtinfarkt massan, som om associerade med maladaptiv remodeling29, kan leda till ökad risk för hjärtsvikt, ett tillstånd som redovisning för 8,5% av alla dödsfall tillskrivas hjärt- sjukdom30.
Här beskriver vi våra protokoll som kombinerar i situ hybridisering med digoxigenin-märkt (DIG) låst nukleinsyra (LNA) sond och immunfärgning för samtidiga detektion av miRNA och protein molekyler på mus hjärtat vävnadssnitt, i våra modell av hjärthypertrofi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>DEPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02038</td>
			<td>non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>ProK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 1 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 12 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methylimidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>336092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>39391</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td>H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Sodium Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>339450</td>
			<td>scramble miRNA/U6 snRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>YD00615701</td>
			<td>5&#39;-DIG and 3&#39;-DIG labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisol hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT/BCIP Tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11697471001</td>
			<td>NBT-BCIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P217</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic coverslip</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td>
			<td>RNA-ase free plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>DIG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Pap pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td>cTnT antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>anti-rabbit-568 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Formamide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>UVP HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization

Micro-RNAs (Mirna) är enkelsträngat RNA avskrifter som binder till messenger RNA (mRNA) och hämmar deras översättning eller främja deras nedbrytning. Hittills har MicroRNA varit inblandade i ett stort antal biologiska och sjukdom processer, som signalerat behovet av tillförlitlig upptäckt metoder för miRNA avskrifter. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för digoxigenin-märkt (DIG) låst nukleinsyra (LNA) sond-baserade miRNA detektering, kombinerat med protein immunfärgning på mus hjärtat delar. Det första utfört vi en i situ hybridisering teknik använder sonden för att identifiera miRNA-182 uttryck i hjärtat sektioner från kontroll och hjärthypertrofi möss. Nästa, vi utfört immunfärgning för hjärt Troponin T (cTnT) protein, på samma avsnitt, att samtidig lokalisera miRNA-182 med hjärtmuskelcellen celler. Använder det här protokollet, kunde vi upptäcka miRNA-182 genom ett alkaliskt fosfatas baserat kolorimetriska analys och cTnT genom fluorescerande färgning. Detta protokoll kan användas för att detektera uttryck för någon miRNA av intresse genom gräva-märkt LNA sonder, och relevanta proteinuttryck på mus hjärtat vävnadssnitt.

miRNA i situ hybridisering var optimerad på mus hjärtat sektioner med en rusning miRNA och U6-snRNA, som tjänade som negativa och positiva kontroller respektive. Positiv färgning indikeras i blått, medan negativa färgningen indikeras av avsaknaden av färgutveckling (figur 1A-1B). Hjärtmuskelcellen uttryck av miRNA-182 bedömdes i hjärtat sektioner från kontroll och PlGF överuttryck av möss. Möss bära den PlGF transgenen...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Vävnadsspecifika miRNA uttryck profilering i mus hjärtat sektioner med In Situ -hybridisering

Micro-RNAs (Mirna) är kort och mycket homologa RNA sekvenser, tjänstgör som post-transcriptional regulatorer av messenger RNA (mRNA). Nuvarande metoder för detektion av miRNA varierar i sensitivitet och specificitet. Vi beskriver ett protokoll som kombinerar i situ hybridisering och immunfärgning för samtidiga upptäckt av miRNA och protein molekyler på mus hjärtat vävnadssnitt.

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom mikroRNA-området, genom att tillhandahålla verktyg för att upptäcka den relativa lcalization av både protein och mikroRNA molekyler. Den största fördelen med denna teknik är att du kan upptäcka både protein- och mikroRNA-molekyler från samma vävnadssektion. Detta protokoll börjar med en rehydrering av de glidmonterade vävnaderna.Värm rutschkanorna i 60 grader Celsius i 10 minuter i hybridiseringsugnen. Paraffinet ska vara synligt smältande. Sedan, inkubera diabilder i ett glas Coplin burk som innehåller kommersiellt tillgängliga clearing agent i 10 minuter.Gör det här två gånger. Därefter överför du objektglasen från tvätt till tvätt för att rehydrera vävnaderna. När hydrerad, inkubera vävnaderna i proteinas K arbetslösning vid 37 grader Celsius i 15 minuter.För att ta bort proteinasen K, tvätta objektglasen i 1x PBS två gånger. Nu, fixa vävnaderna. Först gör reservoarer på bilderna med hjälp av en hydrofoba penna för att dra en vattenavvisande cirkel runt förberedelserna.Därefter applicera 500 mikroliter av 4%PFA lösning inom barriären, och inkubera objektglasen i en rök huva. För att ta bort fixativet, tvätta objektglasen i en Coplin burk som innehåller PBS i fem minuter två gånger i rumstemperatur. Därefter tvättar du objektglasen i 0,13 molar 1-Methylimidazole i 10 minuter.Gör detta i rökhuven vid rumstemperatur, och utför denna tvätt två gånger. Tillsätt EDC fixativ, och inkubera vid rumstemperatur i en rök huva i en timme. Skölj av objektglasen med 50-millimolar Tris.För att förbereda för hybridiseringen, först bygga en befuktad kammare. Fyll på två bitar av filter eller mjukpapper i botten av en låda, och blöt papperet med en en-till-en blandning av formamid och 1x SSC. Därefter applicerar du 200 mikroliter av förvuppverad hybridiseringslösning på varje objektglas, och inkubera den fuktade kammaren av glidbanor i en till tre timmar vid 50 grader Celsius.Efter inkubationen, byt ut hybridiseringslösningen med 250 mikroliter av problösning, och täck in objektglasen med en RNase-fri täckglidning. Försök att undvika att fånga luftbubblor under luckan. Nu, försiktigt försegla kammaren med parafilm, och inkubera diabilderna över natten vid cirka 30 grader Celsius under RNA smälttemperaturen i sonden.Optimering kan krävas. Förutom att ställa in rätt inkubationstemperatur uttrycks olika mikroRNA på olika nivåer, så optimering avseende probkoncentrationen kan också krävas för att få den optimala signalen. Efter hybridiseringen, utför stringenstvättar.Först var i 2x SSC vid 50 grader Celsius i fem minuter, eller tills locket glider lossna. Utför sedan två tvättar i 2x SSC vid rumstemperatur, var och en i fem minuter. Sedan fortsätter i rumstemperatur, tvätta diabilderna i fem minuter i 0.2x SSC, följt av fem minuter i PBST, och slutligen, fem minuter i 1x PBS.Vid denna punkt är RNA-RNA-hybriderna stabila, och RNA-stränga villkor behövs inte längre. För DIG-antikroppsdetektion, först, röra upp de hydrofoba barriärerna, och applicera 500 mikroliter av blockerande lösning i trettio minuter. Inkubera rutschkanorna i rumstemperatur i en befuktad kammare.Därefter tar du bort blockeringslösningen och ersätter den med 500 mikroliter av DIG-antikroppslösning. Inkubera rutschkanorna i rumstemperatur i en befuktad kammare i en timme. Sedan, med Coplin burkar, tvätta diabilder tre gånger i PBST i fem minuter per tvätt.Därefter tvättar du objektglasen i förfärgningslösning i fem minuter två gånger. Sedan, överföra diabilder till en polypropylen slide mailer burk, och tillsätt 20 milliliter AP substratlösning. Nu, inkubera bilderna på 37 grader Celsius i sex till 24 timmar, skyddad från ljuset.När du först använder AP substrat, är det viktigt att följa reaktionen. På två timmars intervall, kontrollera färgutvecklingen på objektglasen med hjälp av mikroskop, tills en optimal inkubationstid har fastställts. För att avlägsna det överflödiga AP-substratet, tvätta objektglasen två gånger i KTBT-lösning i fem minuter per tvätt, följt av en tvätt i PBS i fem minuter.För att upptäcka cTNT-antikroppen, först, blockera vävnaderna i en timme. Applicera sedan 200 mikroliter av cTNT-antikroppslösning och inkubera bilderna över natten vid 4 grader Celsius i en befuktad kammare. Nästa dag, tvätta diabilderna i en Coplin burk som innehåller PBS i fem minuter.Gör det här tre gånger. Applicera sedan 250 mikroliter antikanin 568 antikroppslösning och inkubera bilderna i en timme vid rumstemperatur i en fuktad kammare. För att tvätta bort den överflödiga sekundära antikroppen, använd tre femminuterstvättar i PBS.Applicera sedan 250 mikroliter av DAPI-arbetslösning, och inkubera objektglasen i en minut, skyddad från ljus. För att ta bort överskottet DAPI fläcken, använd två fem minuters PBS tvättar, och efter tvättar, montera bilderna. MicroRNA in-situ hybridisering optimerades på mus hjärta sektioner med hjälp av en förvrängd microRNA för negativ kontroll, och en U6 snRNA som en positiv kontroll.Kardiomyocyte-specifika uttryck av microRNA-182 bedömdes i hjärtat sektioner från kontroll och PlGF-överuttryckning möss. Mössen bar en PlGF-transgen under en alfa-MHC-promotor, och utvecklade hjärthypertrofi, sekundärt till ökad angiogenes, inom sex veckor efter transgenaktivering. Färgning protokollet visade ökat uttryck för microRNA-182 i hjärtan PlGF möss.Nästa, för att bestämma vilka celltyper uttryckta microRNA-182, var samma avsnitt immunstained för cTNT. DAPI färgning användes också. I både kontroll och PlGF mus hjärtsektioner, microRNA-182 hittades i kärnfacket i cTNT-positiva kardiomyocyte celler.Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man utför microRNAse hybridisering, följt av protein immunfärgning. Samtidigt försöker detta förfarande, Det är mycket viktigt att komma ihåg att hålla RNAse-fria förhållanden hela dag ett, under alla steg som leder fram till prop hybridisering. Efter detta förfarande, andra metoder som Western blot i en realtid PCR kan utföras för att svara på frågor som, vad är de relativa uttrycksnivåerna för denna speciella microRNA i olika vävnader, eller detta speciella protein i samma vävnad avsnitt.Glöm inte att det kan vara extremt farligt att arbeta med fixativ som PFA och ADC. Försiktighetsåtgärder, inkluderar bär handskar och lab rockar, samt att använda rök huvar, bör alltid vidtas när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Märkning av mitokondrie-DNA-replikering i Drosophila vuxen Äggstockar från edu färgning

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Mätning av dygnsrytm klocka genuttryck och hormon i mänskliga primära cellkulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Slumpmässig mutagenes med användning Histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Upptäckt av Inter-kromosomala Stabila Aberrations av flera Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) och Spectral karyotypering (SKY) i bestrålade möss

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encelliga profilering av genuttryck med FACS och qPCR med interna standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA Replication Timing med zebrafiskar som ett In Vivo -modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick tarmar av hela-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...