Name: tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Athanasios Papangelis, el yazması kritik Yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. FM Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC; tarafından desteklenen BB/M009424/1). IP Amerikan Kalp Derneği Bilim adamı kalkınma hibe tarafından (17SDG33060002) desteklenir.

Fare kalp doku örnekleri bu çalışma için ilgili kanun ve kurumsal yönergelere uygun olarak elde edilmiştir ve Yale Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. çözüm hazırlık
<ol><li>RNase free GKD2O hazırlamak, GKD2O 5 L 5 mL % 0,1 diethylpyrocarbonate (DEPC) ile tedavi tarafından (O/N), gecede oda sıcaklığında (RT). DEPC devre dışı bırakmak için (121 ° C) basınçlı kap. Kullanım DEPC tedavi GKD...

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+primary+microRNAs+by+the+Microprocessor+complex.">Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex.</a> Nature. 432, 231-235 (2004).</li><li>Hutvagner, G., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+in+a+multiple-turnover+RNAi+enzyme+complex.">A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex.</a> Science. 297, 2056-2060 (2002).</li><li>Krol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+microRNA+(miRNA)+precursors+and+their+relevance+to+miRNA+biogenesis+and+small+interfering+RNA/short+hairpin+RNA+design.">Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design.</a> Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).</li><li>Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+microRNA+genes.">Vertebrate microRNA genes.</a> Science. 299, 1540 (2003).</li><li>Tian, T., Wang, J., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+microRNA+detection+methods.">A review: microRNA detection methods.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).</li><li>Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+potentiate+neural+development.">MicroRNAs potentiate neural development.</a> Neuron. 64, 303-309 (2009).</li><li>Ivey, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulation+of+cell+lineages+in+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).</li><li>Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-specific+MicroRNAs.">Embryonic stem cell-specific MicroRNAs.</a> Developmental cell. 5, 351-358 (2003).</li><li>Kasper, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+Establish+Uniform+Traits+during+the+Architecture+of+Vertebrate+Embryos.">MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos.</a> Developmental cell. 40, 552-565 (2017).</li><li>Liu, N., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+regulatory+networks+in+cardiovascular+development.">MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development.</a> Developmental cell. 18, 510-525 (2010).</li><li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+control+in+the+immune+system:+basic+principles.">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li><li>Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miRNA+Interactome+in+Metabolic+Homeostasis.">The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis.</a> Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).</li><li>Ying, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue+Macrophage-Derived+Exosomal+miRNAs+Can+Modulate+In+Vivo+and+In+Vitro+Insulin+Sensitivity.">Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.</a> Cell. 171, 372-384 (2017).</li><li>Perkins, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+expression+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia+and+schizoaffective+disorder.">microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder.</a> Genome biology. 8, R27 (2007).</li><li>Miller, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-132+dysregulation+in+schizophrenia+has+implications+for+both+neurodevelopment+and+adult+brain+function.">MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).</li><li>Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derepression+of+a+neuronal+inhibitor+due+to+miRNA+dysregulation+in+a+schizophrenia-related+microdeletion.">Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion.</a> Cell. 152, 262-275 (2013).</li><li>Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+psychiatric+disorders+with+a+focus+on+autism+spectrum+disorder:+Current+progress+in+genetic+association+studies,+expression+profiling,+and+translational+research.">MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research.</a> Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+integrative+analysis+implicates+microRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder.">Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li><li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microRNA+expression+in+human+heart+disease.">Altered microRNA expression in human heart disease.</a> Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).</li><li>Mann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NF-kappaB-microRNA+regulatory+network+tunes+macrophage+inflammatory+responses.">An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses.</a> Nature Communications. 8, 851 (2017).</li><li>O'Connell, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-155+promotes+autoimmune+inflammation+by+enhancing+inflammatory+T+cell+development.">MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development.</a> Immunity. 33, 607-619 (2010).</li><li>Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+microRNAs:+from+subtype+profiling+to+predictors+of+response+to+therapy.">Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+component+of+the+p53+tumour+suppressor+network.">A microRNA component of the p53 tumour suppressor network.</a> Nature. 447, 1130-1134 (2007).</li><li>Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+functions+of+microRNAs+in+animal+development+and+disease.">The diverse functions of microRNAs in animal development and disease.</a> Developmental cell. 11, 441-450 (2006).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-182+Modulates+Myocardial+Hypertrophic+Response+Induced+by+Angiogenesis+in+Heart.">miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart.</a> Science Reports. 6, 21228 (2016).</li><li>Meerson, F. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+hyperfunction+of+the+heart+and+cardiac+insufficiency.">Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency.</a> Circulation Research. 10, 250-258 (1962).</li><li>Tardiff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+hypertrophy:+stressing+out+the+heart.">Cardiac hypertrophy: stressing out the heart.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).</li><li>Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+ventricular+remodeling:+mechanisms:+part+1+of+2.">Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2.</a> Circulation. 128, 388-400 (2013).</li><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146-e603 (2017).</li><li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues.">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nature Methods. 6, 139-141 (2009).</li></ol>

miRNA transkript algılama duyarlılık, özgüllük ve nicel güç farklı farklı teknikleri ile elde edilebilir. Burada, biz miRNA in situ hibridizasyon immunostaining ile kaplin göstermek ve aynı kalp bölümlerinde miRNA ve protein molekülleri ifade düzeylerde eşzamanlı değerlendirilmesi için izin veren bir protokol açıklayın. Biz ilk kazmak etiketli LNA miRNA probları in situ hibridizasyon gömülü parafin kalp bölümler üzerinde gerçekleştirmek nasıl göstereceğim. Daha sonra a...

Mikro-RNA'ların (miRNAs) çoğu kısa (18-25 nukleotid), gen ekspresyonu çoğu düzeyinde negatif düzenleyiciler olarak inhibe mesajcı RNA (mRNA) çeviri ve/veya mRNA yıkımı teşvik tarafından işlev tek iplikçikli, kodlamayan RNA'ların 1. miRNAs transkripsiyonu intron veya kodlama ekzonlar veya kodlamayan genler ve are i ciddi kısa sap-ilmik yapılar 70 nükleotit2habercisi miRNAs (pre-miRNAs), DROSHA tarafından çekirdeğine içinde. Sitoplazmik takip verme, pre-miRNAs daha da 18-25 nükleotit3,4span olgun miRNAs DICER tarafından işlenir. Daha sonra RNA-induced silencing kompleksi (RISC) bu miRNAs tek iplikçikli RNA'ların, onların ifade3,5 bastırmak sağlayan 3' çevrilmeyen bölgesi (3'-UTR) onların hedef mRNA'ların kendi bağlama için birleştirmek .
Bu yana ilk kez tespit, son üç yıl içinde kendi ifade yüzey are sıkı kontrol6gen ekspresyonu ana düzenleyiciler için miRNAs ortaya çıkmıştır. MiRNAs için rolleri organ gelişimi7,8,9,10,11,12', bakım homeostazı13,14 tarif var , yanı sıra nörolojik15,16,17,18,19, kardiyovasküler20, dahil hastalığı bağlamlarda otoimmün koşulları21 ,22, kanserler23,24ve diğerleri25. MiRNA ifade kalıplarının alaka için takdir artan ileri miRNA transkript güvenilir algılama yöntemleri ihtiyacını getirdi. Gerçek zamanlı PCR, microarrays, Kuzey kurutma, in situ hibridizasyon ve diğerleri, gerçeğini miRNA transkript kısa bir oluşmaktadır nedeniyle hangi duyarlılık, özgüllük ve nicel güç, ağırlıklı olarak farklı tür yöntemler içerir ve Son derece homolog dizileri6.
Biz son zamanlarda miRNA-182 miyokardiyal hipertrofisi26, kalp yükseltilmiş hemodinamik talepleri27,28yanıt olarak yapısal uyum açıklayan bir koşul geliştirilmesi için önemli bir rol bildirdi. Kalp hipertrofisi, uyumsuz remodeling29ile ilişkilendirirseniz riski kalp yetmezliği, tüm ölümlerin % 8.5 için kardiyovasküler atfedilebilecek muhasebe bir koşul için yol açabilir miyokardiyal kitle, artış ile karakterizedir hastalık30.
Burada, içinde bir digoxigenin etiketli (kazmak) kilitli nükleik asit (LNA) prob ve miRNA ve protein molekülleri fare kalp doku bölümlerinde, eşzamanlı tespiti için immunostaining in situ hibridizasyon birleştirir bizim protokol açıklamak bizim kalp hipertrofisi modeli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>DEPC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02038</td>
			<td>non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>ProK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 1 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA48</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution, 12 N</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Methylimidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>336092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>39391</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution H2O2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td>H2O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>Sodium Citrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>339450</td>
			<td>scramble miRNA/U6 snRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>YD00615701</td>
			<td>5&#39;-DIG and 3&#39;-DIG labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisol hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT/BCIP Tablets</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11697471001</td>
			<td>NBT-BCIP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P217</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution (1mg/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic coverslip</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td>
			<td>RNA-ase free plastic coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11093274910</td>
			<td>DIG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>Pap pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cardiac Troponin T antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92546</td>
			<td>cTnT antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>anti-rabbit-568 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized Formamide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>UVP HB-1000 Hybridizer</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue-specific mirna expression profiling in mouse heart sections using in situ hybridization

Mikro-RNA'ların (miRNAs) tek iplikçikli RNA transkript haberci RNA (mRNA) bağlamak ve onların çeviri inhibe veya onların yıkımı teşvik vardır. Bugüne kadar miRNAs içinde miRNA transkript güvenilir algılama yöntemleri ihtiyacını miktarlara hastalığı ve Biyolojik süreçler, çok sayıda karıştığı olmuştur. Burada, biz fare kalp bölümlerinde protein immunostaining ile birlikte digoxigenin etiketli (kazmak) kilitli nükleik asit (LNA) miRNA sonda tabanlı algılama için detaylı bir protokol tanımlamak. İlk olarak, situ hibridizasyon tekniği miRNA-182 ifadede denetim ve kalp hipertrofisi fareler kalp bölümleri tanımlamak için sonda kullanarak gerçekleştirilen. Daha sonra immunostaining kardiyak Troponin T (cTnT) protein, miRNA-182 cardiomyocyte hücrelerle birlikte yerelleştirmek için aynı bölümleri için gerçekleştirilen. Bu iletişim kuralını kullanan, biz Renkölçer tahlil ve floresan boyama yoluyla cTnT miRNA-182 alkalen fosfataz aracılığıyla göre tespit edebildik. Bu iletişim kuralı aracılığıyla kazmak etiketli LNA probları ilgi herhangi bir miRNA ifade ve fare kalp doku bölümlerinde ilgili protein ifade algılamak için kullanılabilir.

miRNA in situ hibridizasyon kapış miRNA ve U6-snRNA, sırasıyla negatif ve pozitif denetimleri hizmet kullanarak fare kalp bölümlerde optimize edildi. Pozitif boyama belirtilir mavi, negatif boyama renk geliştirme eksikliği gösterilir iken (Şekil 1A-1B). MiRNA-182 Cardiomyocyte belirli ifade denetim ve PlGF overexpressing fareler kalp bölümleri değerlendirildi. Bir αMHC organizatörü altında PlGF transgene taşıyan fa...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization at JoVE.com

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

Mikro-RNA'ların (miRNAs) haberci RNA (mRNA) çoğu düzenleyiciler hizmet veren kısa ve son derece homolog RNA dizileri vardır. Geçerli miRNA algılama yöntemleri duyarlılık ve özgüllük değişir. Situ hibridizasyon ve immunostaining eşzamanlı miRNA ve protein molekülleri fare kalp doku bölümlerinde algılanması için bir araya getiren bir protokolü açıklar.

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Bu yöntem, hem protein hem de mikroRNA moleküllerinin göreceli lcalization tespit etmek için araçlar sağlayarak, mikroRNA alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı aynı doku bölümünden hem protein hem de mikroRNA moleküllerini tespit edebiliyor olmasıdır. Bu protokol, kaydırağa monte edilen dokuların rehidrasyonu ile başlar.Hibritleştirme fırınında 10 dakika boyunca 60 derecede kaydırakları ısıtın. Parafin gözle görülür bir şekilde eriyor olmalı. Daha sonra, 10 dakika boyunca ticari olarak kullanılabilir takas maddesi içeren bir cam Coplin kavanoz slaytlar kuluçka.Bunu iki kez yap. Daha sonra, dokuları yeniden sulamak için yıkamak için slaytlar aktarın. Bir kez sulu, proteinaz K çalışma çözeltisi dokuları kuluçka 37 derece santigrat dakika boyunca.Proteinaz K'yi çıkarmak için slaytları 1x PBS'de iki kez yıkayın. Şimdi, dokuları düzeltin. İlk olarak, preparatlar etrafında su itici bir daire çizmek için bir hidrofobik kalem kullanarak slaytlar üzerinde rezervuarlar olun.Daha sonra, bariyer içinde% 4 PFA çözeltisi 500 mikrolitre uygulayın ve bir duman kaputiçinde slaytlar kuluçka. Fiksatif kaldırmak için, oda sıcaklığında beş dakika iki kez PBS içeren bir Coplin kavanozda slaytlar yıkayın. Daha sonra, 0.13 molar 1-Methylimidazole 10 dakika slaytlar yıkayın.Oda sıcaklığında duman kaputunda bunu yapın ve bu yıkamayı iki kez yapın. EDC fiksatif ekleyin ve bir saat boyunca bir duman kaputoda sıcaklığında kuluçka. 50-milimolar Tris ile slaytlar durula.Melezleşmeye hazırlanmak için önce nemli bir oda inşa edin. Bir kutunun altına iki parça filtre veya mendil kağıdı yükleyin ve kağıdı formamid ve 1x SSC karışımıyla ıslayın. Daha sonra, her slayt için önceden ısıtılmış hibridizasyon çözeltisi 200 mikrolitre uygulayın ve 50 santigrat derece bir ila üç saat boyunca slaytların nemlendirilmiş odası kuluçka.Kuluçkadan sonra, hibridizasyon çözeltisini 250 mikrolitre prob çözeltisi ile değiştirin ve slaytları RNase içermeyen kapak fişi ile kapatın. Kapak kayma altında hava kabarcıkları bindirme önlemek için deneyin. Şimdi, odayı dikkatlice parafilmle kapatın ve slaytları bir gecede sondanın RNA erime sıcaklığının yaklaşık 30 derece altında kuluçkaya yatırın.Optimizasyon gerekebilir. Doğru kuluçka sıcaklığını ayarlamanın yanı sıra, farklı mikroRNA'lar farklı seviyelerde ifade edilir, bu nedenle en uygun sinyali almak için sonda konsantrasyonu ile ilgili optimizasyon da gerekebilir. Melezlemeden sonra, sıkı yıkAmaları gerçekleştirin.İlk olarak, 2x SSC 50 derece santigrat beş dakika, ya da kapak fişleri gevşeyene kadar oldu. Daha sonra, oda sıcaklığında 2x SSC iki yıkama gerçekleştirmek, beş dakika boyunca her. Daha sonra, oda sıcaklığında devam ederek, slaytları 0,2x SSC'de beş dakika, PBST'de beş dakika ve son olarak 1x PBS'de beş dakika boyunca yıkayın.Bu noktada, RNA-RNA melezleri kararlıdır ve RNA-sıkı koşullara artık ihtiyaç duyulmamaktadır. DIG antikor tespiti için, ilk olarak, hidrofobik bariyerler dokunun ve otuz dakika boyunca engelleme çözeltisi 500 mikrolitre uygulayın. Bir nemli odada oda sıcaklığında slaytlar kuluçka.Daha sonra, engelleme çözeltisini çıkarın ve 500 mikrolitre DIG antikor çözeltisi ile değiştirin. Bir saat boyunca nemli bir odada oda sıcaklığında slaytlar kuluçka. Daha sonra Coplin kavanozlarını kullanarak slaytları PBST'da üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın.Daha sonra, slaytları ön boyama çözeltisinde iki kez beş dakika yıkayın. Ardından, slaytları bir polipropilen slayt posta kavanozuna aktarın ve 20 mililitre AP substrat çözeltisi ekleyin. Şimdi, slaytları 37 derecede 6 ila 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın, ışıktan korunun.AP substratını ilk kullandığınızda reaksiyonu takip etmek önemlidir. İki saatlik aralıklarla, en uygun kuluçka süresi belirlenene kadar bir mikroskop kullanarak slaytlarda renk gelişimini kontrol edin. Fazla AP alt tabakasını çıkarmak için, slaytları ktbt çözeltisinde iki kez yıkama başına beş dakika, ardından pbs'de beş dakika yıkayın.CTNT antikorlarını tespit etmek için önce dokuları bir saat boyunca kapatın. Daha sonra, 200 mikrolitre cTNT antikor çözeltisi uygulayın ve bir gecede 4 derece nemli bir odada slaytları kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, beş dakika pbs içeren bir Coplin kavanozda slaytlar yıkayın.Bunu üç kez yap. Daha sonra, anti-tavşan 568 antikor çözeltisi 250 mikrolitre uygulayın ve nemli bir odada oda sıcaklığında bir saat boyunca slaytlar kuluçka. Aşırı sekonder antikorları temizlemek için PBS'de beş dakikalık üç yıkama kullanın.Daha sonra, istenirse, 250 mikrolitre DAPI çalışma çözeltisi uygulayın ve slaytları ışıktan korunan bir dakika kuluçkaya yatırın. Fazla DAPI lekesini çıkarmak için iki beş dakikalık PBS yıkınve yıkandıktan sonra slaytları monte edin. MicroRNA in-situ hibridizasyon negatif kontrol için şifreli bir microRNA kullanılarak fare kalp bölümlerinde optimize edildi ve pozitif kontrol olarak bir U6 snRNA.MikroRNA-182'nin kardiyomiyosite özgü ekspresyonu kontrol ve PlGF-aşırı eksprese edici farelerden kalp kesitlerinde değerlendirildi. Fareler bir alfa-MHC promotörü altında plgf transgeni taşıdı, ve artmış anjiyogenez ikincil kardiyak hipertrofi geliştirdi, transgen aktivasyonu altı hafta içinde. Boyama protokolü plGF farelerin kalplerinde mikroRNA-182 artan ifade ortaya koymuştur.Daha sonra hangi hücre tiplerinin mikroRNA-182'yi ifade ettigini belirlemek için aynı kesitler cTNT için immünosüle edildi. DAPI boyama da kullanıldı. Hem kontrol hem de PlGF fare kalp kesitlerinde mikroRNA-182 cTNT-pozitif kardiyomiyosit hücrelerinin nükleer bölmesinde bulundu.Bu videoyu izledikten sonra, nasıl mikroRNAS hibridizasyon gerçekleştirmek için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır, protein immünboyama takip. Bu yordamı çalışırken, ilk gün boyunca RNaAse içermeyen koşulları korumak için hatırlamak çok önemlidir, tüm adımlar boyunca prop hibridizasyon kadar önde gelen. Bu prosedürü takiben, gerçek zamanlı PCR Batı blot gibi diğer yöntemler gibi sorulara cevap için yapılabilir, farklı dokularda bu özel mikroRNA göreli ifade düzeyleri nelerdir, ya da aynı doku bölümünde bu özel protein.PFA ve ADC gibi fiksatiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlemi gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymenin yanı sıra duman başlıkları kullanan önlemler her zaman alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...