Denne teknik kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for immunologi området. Såsom, bestemme, hvordan monocyt delmængde proportioner, eller udtryk for forskellige markører, ændres i sygdom stater. Den største fordel ved denne teknik, er, at cellerne er tæt på deres oprindelige tilstand, og at klare instruktioner og begrundelse anvendes, at give en standardiseret gating metode.
Generelt, personer nye til denne metode kan kæmpe, fordi mange papirer ikke giver klare instruktioner om, hvordan gating af cellerne blev udført. Begynd denne protokol med indsamling af blodprøver og bestemmelse af antallet af hvide blodlegemer, som beskrevet i tekstprotokollen. Fortyndet blodet med fosfat-bufferet saltvand, at justere koncentrationen til ca 5 millioner hvide blodlegemer pr milliliter.
Forbered tilstrækkelig master mix for antallet af rør ved at kombinere blod, anti CD14-V450, anti CD16-APC og anti HLA-DR-PerCP. Vortex og pipette 51,9 mikroliter af mix i hvert rør. Tilføj PE mærket M1 og M2 markør antistoffer, samt markører for T-celler, B-celler, neutrofiler, og naturlige dræberceller til deres tilsvarende rør.
Vortex og inkubere i 30 minutter ved fire grader celsius i mørke. Nu tilsættes 250 mikroliter af kombinerede røde blodlegemer lysis og hvide blodlegemer fastsættelse løsning, og straks vortex blandingen, forsigtigt. Inkuber den vortexed blandingen i 10 minutter i mørke, ved fire grader celsius.
Efter 10 minutter tilsættes 250 mikroliter PBS og drejer cellerne ned ved 260 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatant, og resuspend cellerne i 300 mikroliter af 1% formaldehyd. Opbevar cellerne ved fire grader celsius, beskyttet mod lys, indtil analysen udføres.
Flowcytometri skal udføres inden for 48 timer efter prøvetilberedningen. Til at begynde, kontrollere flow cytometer log for at sikre faciliteten personale har udført kvalitetskontrol. For at oprette flow cytometri eksperiment, skal du klikke på nye eksperiment, efterfulgt af nye prøve og nye rør, for at tilføje rør.
Vælg bivariate plots ved at klikke på ikonet, og brug rullemenuerne til at vælge adgangsparametrene. Sikre inddragelse af en CD16/CD14 plot og et plot, der viser en detektor sammen med tiden, for at overvåge erhvervelsen. Indsæt røret og klik, erhverve.
Kontroller instrumentspændingsindstillingerne, og kontroller, at detektorsignalerne ikke er af skala. Overhold celler, der falder i monocytporten i CD14/CD16-plottet. Indstil optagelsesgrænsen til 5.000 begivenheder for den klassiske monocytport, og klik på rekord.
Fortsæt med at registrere data for de resterende rør. Når data for alle rør er registreret, skal flowdataene eksporteres som fcs-filer til analyse. Hvis du vil udføre monocytgating, skal du åbne filer i analysesoftwaren, dobbeltklikke på tubenavnet og vælge parametre i rullemenuerne for at visualisere cellerne på et fremadrettet scatter-område i forhold til området for fremadrettet scatter-højde.
Opret en doublet udelukkelse gate, ved at klikke på polygon gate værktøj ikon, og omslutter cellerne. Markér de indhegnede celler ved at dobbeltklikke på det indhegnede område. Juster rullemenuparametre i den nye visningsboks for at få vist cellerne på et område med fremadsede punkt i forhold til side scatter-område.
Klik på det rektangulære portikon, og vælg generøst den monocytepopulation, der er baseret på fremadrettede og side scatter egenskaber, for at udelukke størstedelen af lymfocytter, naturlige dræberceller og granulocytter. Markér de gatede celler, og gensendes på et CD14/CD16-plot, hvor du vælger parametrene ved hjælp af rullemenuerne. Klik på polygon porten, for at vælge monocytter baseret på deres karakteristiske, omvendt l form.
Hvis den ikke-klassiske population ikke adskiller sig fra cellerne til venstre, er det sandsynligt, at forureningen er sandsynlig og bør undersøges. Markér de gatede celler, og vis monocyterne på et CD/16 HLA-DR-plot ved at bruge rullemenuerne til at vælge parametre. Klik på polygonporten for at vælge HLA-DR-positive celler, og udeluk eventuelle resterende naturlige dræberceller og neutrofiler.
Markér de indhegnede celler, og vis HLA-DR-positive celler på et CD14/HLA-DR-plot ved hjælp af rullemenuer til at vælge parametre. Klik på polygonporten, og tegn en port for at udelade HLA-DR high/CD14 low B-cellerne. Markér de gatede celler, og brug rullemenuerne til at få dem vist på et CD16/CD14-plot.
Fra plot muligheder, skal du vælge zebra plot, som vil gøre det muligt monocyt delmængde porte, der skal tegnes, at bestemme delmængde proportioner. Nu skal du klikke på den rektangulære gate ikon, og vælg de klassiske monocytter ved at tegne en omtrentlig rektangulær port omkring CD14 høj /CD16 lav klassisk monocyt befolkning. Vælg, vis medianer under displayet for at få vist medianinfluorescensintensiteten for klassiske monocytter.
Juster porten, så populationen har en ligelig fordeling fra medianen til venstre og til højre og omfatter alle cellerne til venstre. Vælg den mellemliggende population ved at tegne en rektangulær port, der omfatter cellerne til højre for den klassiske port. Juster bunden af porten for at udelukke de ikke-klassiske celler ved at justere porten med bunden af de koncentriske cirkler, der er helt inden for den klassiske monocytport.
Gate den ikke-klassiske delmængde, ved at trække en rektangulær boks ned fra den nederste kant af den mellemliggende delmængde, vælge alle cellerne til bunden af populationen. Vælg, vis gatefrekvenser under Display for at bestemme procentdelen af hver monocytdelmængde. Endelig skal du markere celler fra hver monocytdeldel.
Rediger rullemenuparametrene for at oprette et histogram for hvert monocytundersæt, der viser hvert mærke. Beregn derefter udtryksgraden ved hjælp af median- eller geometrisk middelværdi som beskrevet i tekstprotokollen. Succesfuld gated monocyt populationer er vist her.
Og proportionerne er på linje med dem i litteraturen. Andelene for denne stikprøve blev beregnet som 88,1 % klassisk, 4,33 % mellemprodukter og 7,49 % ikke-klassisk. Ved at vurdere den relative position af andre populationer, er det klart, at T-celler og neutrofiler vist her i blåt, følge et godt stykke uden for monocyt, omvendt l form, på en CD16/CD14 plot.
Men både de naturlige dræberceller og B-cellepopulationer, vist her i blåt, overlappede med den ikke-klassiske monocytpopulation. Varmekort, der bekræfter, at forurenende celletyper er blevet fjernet, vises her. De naturlige dræberceller er blevet lukket ud af HLA-DR CD16 trin, mens B-cellerne er blevet gated ud af HLA-DR CD/14 trin.
Udtrykket af M1 og M2 markører i blåt, i forhold til deres isotype kontrol med rødt, er vist her. CD120b en M1-markør viser et klart skift over isotypekontrol for alle monocytdelgrupper. Dette er også tilfældet for CD93 en M2 markør, med udtryk er højere i klassisk, moderat på mellemprodukter og lav på ikke-klassisk.
Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at sikre forurenende celler er gated ud, da de ellers kan bidrage til kvantificeret udtryk. Efter denne procedure kan andre markører undersøges. For at besvare yderligere spørgsmål, såsom, hvordan monocyt markør udtryk ændringer i sygdom.
Glem ikke, at arbejde med menneskeblod og formaldehyd kan være farligt, og så forholdsregler såsom personlige værnemidler, og ved hjælp af en biologisk hætte, bør altid tages, når du udfører denne procedure.