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October 17th, 2018
DOI :
October 17th, 2018
•0:04
Title
0:42
Sample Preparation for Whole Blood Flow Cytometry
2:14
Flow Cytometry
3:28
Monocyte Gating
7:11
Results: Validation of Gating and Quantification of Marker Expression
8:38
Conclusion
Transcript
इस तकनीक से इम्यूनोलॉजी क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद मिल सकती है। जैसे, यह निर्धारित करना कि रोग राज्यों में मोनोसाइट सबसेट अनुपात, या विभिन्न मार्कर की अभिव्यक्ति कैसे बदल जाती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि कोशिकाएं अपने मूल राज्य के निकट हैं, और मानकीकृत गेटिंग विधि प्रदान करने के लिए स्पष्ट निर्देश और औचित्य का उपयोग किया जाता है।
आम तौर पर, इस विधि के लिए नए व्यक्ति संघर्ष कर सकते हैं, क्योंकि कई कागजात स्पष्ट निर्देश नहीं देते हैं कि कोशिकाओं की गेटिंग कैसे की गई थी। पाठ प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप में रक्त नमूनों के संग्रह और सफेद रक्त कोशिका गिनती के निर्धारण के साथ इस प्रोटोकॉल को शुरू करें। फास्फेट-बफर नमकीन के साथ रक्त को पतला करें, एकाग्रता को लगभग 5 मिलियन सफेद रक्त कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर में समायोजित करने के लिए।
रक्त, एंटी सीडी14-V450, एंटी सीडी16-एपीसी और एंटी एचएलए-डीआर-परसीपी के संयोजन से ट्यूबों की संख्या के लिए पर्याप्त मास्टर मिक्स तैयार करें। भंवर और पिपेट प्रत्येक ट्यूब में मिश्रण के 51.9 माइक्रोलीटर। पीई लेबल M1 और M2 मार्कर एंटीबॉडी, साथ ही टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल, और उनके इसी ट्यूब के लिए प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के लिए मार्कर जोड़ें ।
भंवर और अंधेरे में चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट। अब, संयुक्त लाल रक्त कोशिका लाइसिस और सफेद रक्त कोशिका फिक्सिंग समाधान के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें, और तुरंत मिश्रण भंवर, धीरे। अंधेरे में 10 मिनट के लिए भंवर मिश्रण इनक्यूबेट, चार डिग्री सेल्सियस पर ।
10 मिनट के बाद, पीबीएस के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए, 260g पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें। सुपरनेट को निकालें, और 1% फॉर्मलडिहाइड के 300 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, प्रकाश से संरक्षित जब तक विश्लेषण नहीं किया जाता है।
फ्लो साइटोमेट्री नमूना तैयार करने के 48 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए। शुरू करने के लिए, सुविधा कर्मचारियों को गुणवत्ता नियंत्रण जांच प्रदर्शन किया है सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह साइटोमीटर लॉग की जांच करें । प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोग स्थापित करने के लिए, ट्यूब जोड़ने के लिए नए नमूने और नई ट्यूब के बाद नए प्रयोग पर क्लिक करें।
आइकन पर क्लिक करके, द्विविध भूखंडों का चयन करें, और ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करें, एक्सेस पैरामीटर का चयन करने के लिए। अधिग्रहण की निगरानी के लिए एक CD16/CD14 भूखंड और समय के साथ एक डिटेक्टर प्रदर्शित करने की साजिश को शामिल करना सुनिश्चित करें । ट्यूब डालें और क्लिक करें, प्राप्त करें।
साधन वोल्टेज सेटिंग्स की जांच करें, यह सुनिश्चित करना कि डिटेक्टर सिग्नल स्केल से दूर नहीं हैं। सीडी14/सीडी16 प्लॉट के मोनोसाइट गेट में पड़ने वाली कोशिकाओं का निरीक्षण करें । शास्त्रीय मोनोसाइट गेट के लिए 5, 000 घटनाओं के लिए रिकॉर्डिंग सीमा सेट करें, और रिकॉर्ड पर क्लिक करें।
शेष ट्यूबों के लिए डेटा रिकॉर्ड करना जारी रखें। सभी ट्यूबों के लिए डेटा दर्ज किए जाने के बाद, विश्लेषण के लिए एफसीएस फाइलों के रूप में प्रवाह डेटा का निर्यात करें। मोनोसाइट गेटिंग करने के लिए, विश्लेषण सॉफ्टवेयर में फ़ाइलें खोलें, ट्यूब नाम पर डबल क्लिक करें, और ड्रॉपडाउन मेनू से मापदंडों का चयन करें ताकि कोशिकाओं को आगे स्कैटर क्षेत्र बनाम आगे स्कैटर हाइट प्लॉट पर कल्पना की जा सके।
बहुभुज गेट टूल आइकन पर क्लिक करके, और कोशिकाओं को संलग्न करके, एक डबल अपवर्जन गेट बनाएं। गेटेड क्षेत्र पर डबल क्लिक करके गेटेड कोशिकाओं का चयन करें। नए डिस्प्ले बॉक्स में, ड्रॉपडाउन मेनू मापदंडों को समायोजित करें ताकि कोशिकाओं को आगे स्कैटर एरिया बनाम साइड स्कैटर एरिया प्लॉट पर प्रदर्शित किया जा सके।
आयताकार गेट आइकन पर क्लिक करें, और उदारता से लिम्फोसाइट्स, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और ग्रैनुलोसाइट्स के बहुमत को बाहर करने के लिए, आगे और पक्ष स्कैटर गुणों के आधार पर मोनोसाइट आबादी का चयन करें। गेटेड कोशिकाओं का चयन करें और ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके मापदंडों का चयन करते हुए सीडी14/सीडी16 प्लॉट पर फिर से प्रदर्शित करें। बहुभुज गेट पर क्लिक करें, उनकी विशेषता, उल्टे एल आकार के आधार पर मोनोसाइट्स का चयन करने के लिए।
यदि गैर-शास्त्रीय आबादी कोशिकाओं से उसके बाईं ओर अलग नहीं है, तो संदूषण की संभावना है और इसकी जांच की जानी चाहिए। गेटेड कोशिकाओं का चयन करें, और मापदंडों का चयन करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके, सीडी/16 एचएलए-डीआर प्लॉट पर मोनोसाइट्स प्रदर्शित करें। एचएलए-डीआर पॉजिटिव कोशिकाओं का चयन करने के लिए बहुभुज गेट पर क्लिक करें, और किसी भी शेष प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल को बाहर करें।
गेटेड कोशिकाओं का चयन करें और मापदंडों का चयन करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके सीडी14/एचएलए-डीआर प्लॉट पर एचएलए-डीआर पॉजिटिव कोशिकाओं को प्रदर्शित करें। बहुभुज गेट पर क्लिक करें, और एचएलए-डीआर हाई/सीडी14 कम बी कोशिकाओं को बाहर करने के लिए एक गेट खींचें । गेटेड कोशिकाओं का चयन करें और उन्हें CD16/CD14 प्लॉट पर प्रदर्शित करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करें।
प्लॉट विकल्पों से, जेब्रा प्लॉट का चयन करें, जो सबसेट अनुपात निर्धारित करने के लिए मोनोसाइट सबसेट गेट तैयार करने में सक्षम होगा। अब, आयताकार गेट आइकन पर क्लिक करें, और CD14 उच्च/CD16 कम शास्त्रीय मोनोसाइट आबादी के आसपास एक अनुमानित आयताकार गेट ड्राइंग द्वारा शास्त्रीय मोनोसाइट का चयन करें । प्रदर्शन के तहत, शास्त्रीय मोनोसाइट्स के लिए औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता प्रदर्शित करने के लिए, औसत का चयन करें, दिखाएं।
गेट को इस तरह समायोजित करें कि जनसंख्या में बाईं ओर और दाईं ओर औसत से समान वितरण होता है, और सभी कोशिकाओं को बाईं ओर शामिल किया जाता है। एक आयताकार द्वार तैयार करके मध्यवर्ती आबादी का चयन करें जिसमें कोशिकाओं को शास्त्रीय द्वार के दाईं ओर शामिल किया गया है। गैर-शास्त्रीय कोशिकाओं को बाहर करने के लिए गेट के नीचे समायोजित करें, गेट को गाढ़ा हलकों के नीचे के साथ संरेखित करके, जो पूरी तरह से शास्त्रीय मोनोसाइट गेट के भीतर हैं।
इंटरमीडिएट सबसेट के निचले किनारे से नीचे एक आयताकार बॉक्स ड्राइंग द्वारा, गैर शास्त्रीय सबसेट गेट, जनसंख्या के नीचे करने के लिए सभी कोशिकाओं का चयन । प्रत्येक मोनोसाइट सबसेट का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन के तहत, गेट आवृत्तियों का चयन करें, दिखाएं। अंत में, प्रत्येक मोनोसाइट सबसेट से कोशिकाओं का चयन करें।
प्रत्येक मोनोसाइट सबसेट के लिए एक हिस्टोग्राम बनाने के लिए ड्रॉपडाउन मापदंडों को बदलें, प्रत्येक मार्कर प्रदर्शित करें। फिर, पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित औसत या ज्यामितीय मतलब का उपयोग करके अभिव्यक्ति की डिग्री की गणना करें। सफलतापूर्वक गेटेड मोनोसाइट आबादी यहां दिखाई जाती है।
और अनुपात साहित्य में उन लोगों के साथ कतार में हैं । इस नमूने के अनुपात की गणना 88.1%शास्त्रीय, 4.33% मध्यवर्ती और 7.49% गैर-शास्त्रीय के रूप में की गई थी। अन्य आबादी की सापेक्ष स्थिति का आकलन करके, यह स्पष्ट है कि टी कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल नीले रंग में यहां दिखाया गया है, एक CD16/CD14 भूखंड पर मोनोसाइट, उल्टे एल आकार के बाहर अच्छी तरह से पालन करें ।
हालांकि, दोनों प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और बी सेल आबादी, नीले रंग में यहां दिखाया गया है, गैर शास्त्रीय मोनोसाइट आबादी के साथ छा । हीट मैप्स इस बात की पुष्टि करते हैं कि दूषित सेल प्रकारों को हटा दिया गया है, यहां दिखाए गए हैं। एचएलए-डीआर सीडी16 स्टेप द्वारा नेचुरल किलर सेल्स को गेट आउट किया गया है, जबकि बी सेल्स को एचएलए-डीआर सीडी/14 स्टेप से बाहर कर दिया गया है ।
नीले रंग में M1 और M2 मार्कर की अभिव्यक्ति, लाल रंग में उनके आइसोटाइप नियंत्रण के सापेक्ष, यहां दिखाया गया है । CD120b एक M1 मार्कर, सभी मोनोसाइट सबसेट के लिए, अपने आइसोटाइप नियंत्रण के ऊपर एक स्पष्ट बदलाव दिखाता है। यह सीडी 93 एक एम 2 मार्कर के लिए भी मामला है, अभिव्यक्ति शास्त्रीय में अधिक होने के साथ, मध्यवर्ती पर मध्यम और गैर-शास्त्रीय पर कम।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह सुनिश्चित करना याद रखना महत्वपूर्ण है कि दूषित कोशिकाओं को बाहर निकाला जाए, क्योंकि वे अन्यथा मात्रात्मक अभिव्यक्ति में योगदान दे सकते हैं। इस प्रक्रिया के बाद, अन्य मार्कर की जांच की जा सकती है। आदेश में अतिरिक्त सवालों के जवाब देने के लिए, जैसे, कैसे मोनोसाइट मार्कर अभिव्यक्ति रोग में बदलता है ।
यह न भूलें कि मानव रक्त और फॉर्मलडिहाइड के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है, और इसलिए व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, और बायोहैजार्ड हुड का उपयोग करके, इस प्रक्रिया को करते समय हमेशा लिया जाना चाहिए।
यहां हम पूरे रक्त प्रवाह cytometry द्वारा निस्र्पक monocyte उपसमुच्चय के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह रूपरेखा कैसे गेट करने के लिए उपसमुच्चय और सतह मार्करों की उनकी अभिव्यक्ति का आकलन और एम 1 (भड़काऊ) और M2 मार्करों (विरोधी भड़काऊ) की अभिव्यक्ति के आकलन का एक उदाहरण दे शामिल है ।
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