Name: generation and on-demand initiation of acute ictal activity in rodent and human tissue
Uploaded: 2019-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue at JoVE.com

この作品は、カナダ保健研究機関 (ピーター ・ l ・ カーレン、タウフィック A. Valiante モップ 119603)、(にする A. Valiante)、オンタリオの脳研究所と (マイケル ・ チャン) に Mightex 学生研究助成金によって支持されました。リアム長いビデオの原稿を撮影の彼の援助に感謝したいと思います。数字とこの原稿内のテーブルをコンパイルのパリア Baharikhoob、Abeeshan Selvabaskaran、Shadini Dematagoda を認識したいと思います。図 1 a、 3 a 4 a 6 aチャンらに公開されているデータから作られたすべての元の数字16。

患者を含むすべての研究は、ヘルシンキ宣言に基づき大学健康ネットワーク研究倫理審査会によって承認されたプロトコルの下で行った。プロシージャの動物を含む動物のケアに関するカナダの理事会によるガイドラインに従って、Krembil 研究所動物ケア委員会によって承認されました。
1. プロトコル i: 急性発作の in vitroモデル
<ol><li>郭清のソリューショ?...

<ol>
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脳スライスは proconvulsant 薬やニューラル ネットワークの興奮性を高め、発作時イベント (アノキシア発作様イベント) の沈殿物を促進するために変更されたアプライド出納と扱われます。マウスの体性感覚-運動部最寄のコロナ スライス後板状領域 (RS) のではなく、エリア 2 (CG)、帯状皮質を含める必要があります。これらの解剖学的マーカーは、辺縁系発作時イベントの誘導に最適な各種の?...

急性発作モデルは正常に発作を経験する人の脳波 (EEG) にみられる発作時のイベントを連想させるエレクトロ グラフ署名を再現できます。研究者は、代理として奪取イベント1(ここの発作時のイベント' と呼ばれる) これらの発作のようなイベントを使用します。臨床的に発作時のイベントは、以来、発作が脳から発する神経疾患発作イベントの信頼性の高いプロキシとして機能します。てんかんモニタリング ユニット、神経科医はてんかんの脳の領域を確認し、切除2に分離する発作時イベントの検出に依存します。集中治療室では、医師はどんな発作活動が鎮静患者3に固執する場合を評価する発作時のアクティビティを監視します。てんかん患者の 30% は使用可能な薬4、5、薬剤耐性と薬剤誘発性発作を含む医学の場合の 10% が医療界の挑戦的な問題であることのまま発作を制御します。3標準治療に応答しません。これはアメリカの人口の 10% は彼らの一生の間に 1 つの発作イベントを体験する見込し、3% のてんかん6の発展が予想される社会にとって深刻な懸念を提示します。
発作慢性てんかんモデルでの勉強は、高価な骨の折れるとしばしば7の準備に数ヶ月をかかります。また、動物を自由に移動で電気生理学的記録を行うことは困難です。ひと臨床試験患者の同意、参加者の背景や道徳的、倫理的な考慮事項関連する8の変動に関連する追加の複雑さと同様、同様の問題に直面します。その一方で、急性発作モデル比較的準備に便利、低コスト、大量の研究9発作時のイベントを生成できる、有利です。さらに、条件が電気生理学的記録発作ダイナミクスと関連の基本的な病態を検討する必要を実行するために理想的なので、組織は安定した位置に固定されます。彼らは、脳のすべての固有の要因と取り込めないことがあるシナプスの接続構成ニューロン ネットワークの構成生物学的材料に基づいているため急性発作モデルはインシリコ(コンピューター) モデル上良好のまま最も詳細なコンピューターによって10をモデル化します。これらの機能は、急性発作モデルの潜在的な抗けいれん治療スクリーニングと慢性てんかんモデルと臨床試験のさらなる調査のためにそれらを進める前に予備調査結果を作るで効率的に構えを作る。
通常、急性発作モデルはハイパー興奮性の条件にさらされている正常な脳組織から派生しました。健康的な脳組織の臨床的に関連する発作時イベントを誘発するには、それは、励起 (E) と (I) 抑制がバランスの取れた12脳が重大な状態11で最適に機能するかを理解することが重要。E の混乱-私のバランスは発作時イベントが沈殿させるハイパー興奮性発作状態につながることができます。したがって、この概念の枠組みの中で、脳のスライス (生体外で) または全体の脳 (体内) 準備発作時のイベントを生成する 2 つの主要な方法があります: 抑制 ("disinhibition") を減少または増加励起 ("非-disinhibition")。しかし、発作時のイベントは高い並べられニューラル ネットワーク活動13,14を統制する gaba 作動性介在ニューロンの影響を必要とするイベントを同期します。このため、非脱モデルは、分離のニューラル ネットワークにおける発作時イベントの生成の最も効果的な培養脳スライス15、脱モデル体外一般的に活動をスパイクにつながるに対し、します。発作間欠期のようなスパイクを連想させる。さらに、この概念の枠組みの中で、瞬間的な同期イベントは、確実に発作イベント16をトリガーできます。実際には、発作時のイベントは、重大な状態遷移 (「分岐」) ポイント18時に神経系の17に適用される任意のマイナーな摂動によって引き起こされることができます。伝統的に、これらの摂動は、電気刺激により誘導された.神経科学における光遺伝学の最近の発展しかし、今重大な状態遷移16を誘導するためにより洗練された戦略を提供しています。
このペーパーで説明する方法体外(プロトコルの手順 1) と生体内での研究 (プロトコルの手順 2) の両方のための急性発作モデルでオンデマンドで発作時のイベントを生成する方法を示します。彼らは脳の領域、発作誘導法、研究の種類、および種の選択を含むただし、フォーカスは、さまざまな種類の研究の多様性のため急性 4 AP 皮質発作モデルの推奨される選択になります。4 AP 発作モデル急性体外は電気生理学的記録の質の高い脳スライスを準備する標準プロトコルに基づいており、イメージング研究19。これらのプロトコルは、マウス16,20と人間21の体性感覚運動皮質からコロナ脳スライスを体外に既に使用されています。脳スライスのこれらのタイプの発作時のイベントを生成する変更は以前16と完全な詳細についてはプロトコルの下、実証されています。4 AP 皮質発作モデル急性生体内では、イメージング研究22のために開頭術を準備する標準のプロトコルに基づいています。変更は、(スライド ガラス) ウィンドウがインストールされていないこと、開頭手術の後です。代わりに、proconvulsant エージェント (4 AP) は、動物は、全身麻酔下では発作時のイベントを誘発する露出の皮質に局所的に適用されます。私たちの知る限り、私たちのグループは最初のモデルを開発するこの急性体内皮質発作マウス16,23だった大人のマウスから作製した急性体内4 AP 皮質発作のモデルは、少年組織から培養スライス モデルを補完するために開発されました。2 D 脳スライス (対3-D 全体の脳の非生理的条件に関する固有の懸念に取り組むことによってスライス モデルからの調査結果を一般化するのに役立ちます発作モデル アダルト生体内における所見のレプリケーション構造) および年少および大人のティッシュの生理の違い。
Picospritzer または光遺伝学的戦略と神経伝達物質のいずれかのパフを使用してオンデマンドで発作時イベント開始の方法を示します。我々 の知る限り、私たちのグループは神経伝達物質を介してpicospritzer16を使用して人間の組織で発作時のイベントを開始する最初の。C57BL/6 マウス株は、光遺伝学的戦略、遺伝子を表現するために使用される従来のひずみです。チャネルロドプシン 2 (ChR2) を gaba 作動性介在ニューロンのグルタミン酸作動性の錐体細胞の発現は、短い光パルスを用いたオンデマンドに発作時のイベントを生成するオプションの機能を提供します。適切な光マウス系統にはマウス水疱性 GABA トランスポーター プロモーター (vgat ノックアウト)24、またはマウス胸腺細胞抗原 1 を使用して、ピラミッド型のセルを使用して、いずれかの介在ニューロンに ChR2 を表現する市販の C57BL/6 バリアントが含まれますプロモーター (Thy1)25。これらの市販 vgat ノックアウト ChR2 Thy1 ChR2 マウスは、それぞれ、青と大脳新皮質のグルタミン酸作動性ニューロン、gaba 作動性ニューロンまたはアクティブにする機会を提供 (470 nm) の光。急性発作モデルのオンデマンド発作時のイベントを生成する能力は発作開始ダイナミクスし、潜在的な抗けいれん療法を効率的に評価する新しい機会を提供できます。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through the Toronto Western Hospital&#39;s Suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm syringe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 5/8&#8221; sterile needle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade (2x)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant adhesive glue</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish (2x)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter forceps (2x)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC handle micro spatula</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spoon with flat end</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detailing brush 5/0</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purcahsed from a boutique art store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore transfer pipette</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Tweezer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer (digital)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased on Amazon.ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through the Toronto Western Hospital&#39;s Suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through the Toronto Western Hospital&#39;s Suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)&#160;</td>
			<td>Scientific Systems Design Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4&#183;H2O)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and on-demand initiation of acute ictal activity in rodent and human tissue

医療界の挑戦的な問題のまま発作を制御します。進歩をするためには、研究者は広く研究して発作とその基になるメカニズムを調査する方法必要があります。急性発作モデル便利、電気生理学的記録を実行する能力を提供して、アノキシア発作様 (発作時) イベントの大規模な量を生成することができます。急性発作モデルの有望な結果は慢性てんかんモデルや臨床試験にして高度なことができます。したがって、臨床発作のエレクトロ グラフと動的署名を忠実に再現するモデルが急性の発作を勉強して、ある臨床的に関連性の高い結果を作るために不可欠。急性発作モデル人間のティッシュから準備で発作時のイベントを勉強しても、臨床的に関連する所見を作るため重要です。本稿の重要な焦点は、体内と体外の研究だけでなく、マウスやヒトの組織で発作時のイベントの生成の多様性のための皮質 4 AP モデルです。本稿のメソッドも 0 Mg2 +モデルを用いた発作誘導の代替方法について説明し、利点の詳細な概要と別の生成されたてんかんのような活動の制限を提供する急性発作モデル。また、マウス系統に市販の光を利用して短い (30 ms) の光パルスが自発的に発生しているものと同じ発作時イベントをトリガーする使用できます。同様に、神経伝達物質 (γ-アミノ酪酸、グルタミン酸) の 30-100 ms パフは、自発的に発生しているものと同じです発作時のイベントをトリガーする人体の組織に適用できます。急性発作モデルでオンデマンドに発作時のイベントをトリガーする機能は、発作開始ダイナミクスの根底にある、潜在的な抗けいれん療法を効率的に評価するイベントの正確なシーケンスを観察する新たな能力を提供しています。

100 μ M 4-AP の良質 (無傷) 450 μ m サイズの皮質脳スライスに、少年 vgat ノックアウト ChR2 確実に誘発マウス発作再発 (> 5 s) (図 1Ai) 15 分以内からアプリケーション。100 μ M 4-ap 通信の質の悪いのスライスへの応用結果イベントを破裂、またはスパイク活動 (図 1Aii)。平均すると、ごと切り裂かれたマウスの脳スライスの 40% は、...

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Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue

急性発作モデル、てんかんイベントの基になるメカニズムを研究するために重要です。さらに、てんかんイベント オンデマンドを生成する能力は彼らの開始の基になるイベントの正確なシーケンスを調査する非常に効率的な手法を提供します。ここでは、マウスやヒトの組織に設立された急性 4-アミノピリジン皮質発作モデルについて述べる。

齧歯動物および人間のティッシュの急性発作活動の生成とオン ・ デマンド開始

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics ...

この方法は、電解発作の発症と終了に責任を持つ神経亜集団などの発作メカニズムの研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、それが臨床観察されたものを連想させる、オンデマンド、およびインビボおよびインビトロモデルの電図発作事象を再現できることである。この技術は、異なる抗けいれん薬候補の適用中に電解発作事象を引き起こそうとすることによって、潜在的な抗発作療法を探索するためにも使用することができる。皮質スライスを準備するには、インスタント接着接着剤を使用して、ビブラートメステージに前臨床脳組織を接着します。静かに、スペシミンホルダーをバッファートレイに入れます。脳の後ろ部分がビブラートメのブレードに面していることを確認します。脳を450マイクロメートルの厚い部分にスライスし、腹側方向に裏側に入れます。嗅球を取り除くために前臨床動物の脳の最初のカットを行います。次いで、体性感覚運動領域が観察されるまで、その後の切削を行う。広いボアピペットを使用してください。ターゲットとなるコロナスライスを、冷解解液を含むペトリー皿に移します。コロナスライスの場合は、新皮質のコミュニケーションのすぐ下に横断的なカットを行い、正中線で切断して半球を分離します。その後、新しいカミソリの刃を使用して、スライスから余分な組織を切断します。脳スライス手順を効率的に実行することが重要です。.脳組織がACSFに沈んでいないすべての瞬間は、その品質に有害である。損傷を受け、質の悪い脳組織は、電図発作イベントを発生させる可能性が低い。新皮質を含むコロナスライスの後部を、摂氏35度のACSFで満たされた2番目のペトリー皿に一瞬移します。次いで、速やかに35°Cのカルボゲン化ACSFを含むインキュベーションチャンバーにスライスを移す。脳スライスを35°Cのインキュベーションチャンバーにわずかに水没させて30分間放置します。その後、水浴からインキュベーションチャンバーを取り出し、室温に戻す。電気生理学的記録を行う前に、脳のスライスが回復するまで1時間待ちます。この手順では、脳スライスよりもわずかに大きいレンズペーパーを切り取ります。広孔ピペットまたはディテールブラシを使用して、歯科用トゥイザーを使用して所定の位置に保持されている切り取られたレンズ紙に脳スライスを移します。次に、脳スライスを含むレンズペーパーを記録チャンバーに移し、ハープスクリーンで位置に固定します。その後、1分間に3ミリリットルの速度で35°Cでカルボゲン化ACSFを記録チャンバーで脳スライスを使い過ごします。デジタル温度計を使用して、記録チャンバーが摂氏33~36度であることを確認します。次に、ハミルトンシリンジを使用して、ACSFの10マイクロリットルでガラス電極をバックフィルします。20倍の実体顕微鏡の下で、手動マニピュレータを使用して、記録ガラス電極を表面皮質層(2、3)に導きます。標準的なソフトウェアで脳スライスの電気的活動を表示します。電気的な発作のような活動を誘発するために、100マイクロモルで4-APを含むACSFで脳スライスを多量に使用する。標準的なソフトウェアで脳スライスの電気的活動を表示します。電気的発作のような事象を生成するには、光遺伝学的マウスの脳スライスに光遺伝学的戦略を用いて、手動マニピュレータを使用して、記録領域の真上に1,000ミクロンのコード直径光ファイバーを配置します。青い光の短いパルスを適用して、イクタルイベントを開始します。ユーザーフレンドリーなMATLABベースのプログラムは、インビトロおよびインビボ4-AP発作モデルで発生する様々なタイプのてんかん事象を検出し、分類するために特別に開発されました。この検出プログラムは、ヴァリアンテ研究所の GitHub リポジトリから入手できます。100マイクロモル4-APを若年性VGATチャネルロドプシンマウスから良質の450ミクロンサイズの皮質脳スライスに適用し、15分以内に再発性イクタル様事象を確実に誘導した。100マイクロモル4-APを低品質のスライスに適用すると、イベントが破裂したり、アクティビティがスパイクしたりしました。平均して、各解剖前脳からのスライスの40%が、正常にイクタル状のイベントを生成した。さらに、解剖されたマウスの83%は、少なくとも1つの脳スライスをもたらし、イクタルのような事象を正常に生成した。自発的に起こるictal様事象を有する脳スライスでは、脳スライスに短い30ミリ秒光パルスを適用し、形態において同一のictal様事象を確実に引き起こした。同じ発見は、あなたの1つのチャネルロドプシン2匹のマウスからの脳スライスで行われました。したがって、どのニューロン亜集団が活性化されたかに関係なく、孤立した皮質ニューラルネットワークにおける短い同期イベントは、ictal様事象の発症につながった。これらの氷のような事象は、センチネルスパイク、強壮剤のような発射、クロニックのような発射、および終わりに向かってバーストのような活動で構成されていました。彼らは本質的に臨床発作に関連する電解署名と類似していた。この手順に従って、脳状態遷移の基礎となる神経生物学的メカニズムは何であるかのような質問に対処するために、他のタイプの脳状態遷移を行うことができます。そして、様々な病理学的脳状態への侵入を防ぐために、これらの移行をどのように調節できるでしょうか?

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

神経科学

Measuring Circadian and Acute Light Responses in Mice using Wheel Running Activity

ホイール実行中のアクティビティを使用して、マウスの概日リズムと急性ライト応答を測定する

Circadian rhythms are physiological functions that cycle over a period of approximately 24 hours (circadian- circa: approximate and diem: day)1, 2.  They ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

マウス鋤鼻急性組織スライス標本のイメージングフェロモンセンシング

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

げっ歯類におけるランニングホイール活動の概日リズムの記録および分析

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

急性<em&gt;インビボ</em&gt;麻酔ラットにおけるHyperdirect経路からの局所場ポテンシャルとマルチユニット活性の電気生理学的記録

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

齧歯動物および人間のティッシュの急性発作活動の生成とオン ・ デマンド開始

齧歯動物および人間のティッシュの急性発作活動の生成とオン・デマンド開始