Name: generation and on-demand initiation of acute ictal activity in rodent and human tissue
Uploaded: 2019-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela institutos canadenses de pesquisa em saúde (MOP 119603 para Peter L. Carlen e Taufik A. Valiante), o Instituto do cérebro de Ontário (a Taufik A. Valiante) e a bolsa de pesquisa do estudante de Mightex (para Michael Chang). Gostaríamos de agradecer o Liam Long por sua assistência em filmar o vídeo manuscrito. Gostaríamos de agradecer a Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran e Shadini Dematagoda, por sua assistência na elaboração de figuras e tabelas neste manuscrito. Figura 1A, 3A, 4Ae 6A são todas as figuras originais, feitas a partir de dados publicados em Chang et al . 16.

Toda pesquisa envolvendo pacientes foi realizada sob um protocolo aprovado pelo Conselho de ética da Universidade saúde rede pesquisa em conformidade com a declaração de Helsinque. Procedimentos que envolvam animais estavam em conformidade com as diretrizes do Conselho canadense no cuidado Animal e aprovaram pelo Krembil Research Institute Animal conta Comité.
1. protocolo i: aguda com base no modelo In vitro apreensão
<ol><li>Preparação de soluções de dissecação...

<ol>
	<li>Jefferys, J. G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+basic+mechanisms+of+epilepsy+and+seizures.">Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures.</a> Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).</li><li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+ictal+high-frequency+oscillations+leads+to+favorable+surgical+outcome+in+pediatric+epilepsy.">Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy.</a> Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).</li><li>Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+drug-induced+seizures.">Treatment of drug-induced seizures.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).</li><li>Kwan, P., Brodie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Identification+of+Refractory+Epilepsy.">Early Identification of Refractory Epilepsy.</a> New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).</li><li>Giussani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population-based+study+of+active+and+drug-resistant+epilepsies+in+Northern+Italy.">A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy.</a> Epilepsy &amp; Behavior. 55, 30-37 (2016).</li><li>Pellock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview:+definitions+and+classifications+of+seizure+emergencies.">Overview: definitions and classifications of seizure emergencies.</a> Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).</li><li>L&#246;scher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+of+current+animal+models+of+seizures+and+epilepsy+used+in+the+discovery+and+development+of+new+antiepileptic+drugs.">Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs.</a> Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).</li><li>Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+slices+for+epilepsy+research:+Pitfalls,+solutions+and+future+challenges.">Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).</li><li>Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falc&#227;o, A., Caramona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maximal+electroshock+seizure+(MES)+model+in+the+preclinical+assessment+of+potential+new+antiepileptic+drugs.">The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs.</a> Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).</li><li>Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J., Pitk&#228;nen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Mosh&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortical/Thalamic+In+Silico+Models+of+Seizures+and+Epilepsy.">Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy.</a> Models of Seizures and Epilepsy. , 233-246 (2017).</li><li>Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criticality+in+the+brain:+A+synthesis+of+neurobiology,+models+and+cognition.">Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition.</a> Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).</li><li>Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equalizing+excitation-inhibition+ratios+across+visual+cortical+neurons.">Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons.</a> Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).</li><li>Engel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seizures and epilepsy. , (2013).</li><li>Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptiform+synchronization+in+the+cingulate+cortex.">Epileptiform synchronization in the cingulate cortex.</a> Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).</li><li>Avoli, M., de Curtis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+synchronization+in+the+limbic+system+and+its+role+in+the+generation+of+epileptiform+activity.">GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity.</a> Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).</li><li>Chang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+activation+of+GABAergic+interneurons+initiates+the+transition+to+ictal+events+through+post-inhibitory+rebound+excitation.">Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation.</a> Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).</li><li>Jiruska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+network+activity,+global+increase+in+neuronal+activity,+and+synchrony+expansion+precede+epileptic+seizures+in+vitro.">High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).</li><li>Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+of+seizure+dynamics.">On the nature of seizure dynamics.</a> Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).</li><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).</li><li>Li, H., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+in+chronically+injured,+epileptogenic+sensory-motor+neocortex.">Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex.</a> Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).</li><li>K&#246;hling, R., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+approaches+to+exploring+epileptic+disorders+in+the+human+brain+in+vitro.">Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).</li><li>Ritter, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WONOEP+appraisal:+optogenetic+tools+to+suppress+seizures+and+explore+the+mechanisms+of+epileptogenesis.">WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis.</a> Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Arenkiel, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2.">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).</li><li>Heinemann, U., Pitk&#228;nen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Mosh&#233;, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+slices+from+human+resected+tissue.">Brain slices from human resected tissue.</a> Models of Seizures and Epilepsy. , 285-299 (2017).</li><li>Florez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+recordings+of+human+neocortical+oscillations.">In vitro recordings of human neocortical oscillations.</a> Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).</li><li>Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hippocampal+slice+preparation+and+hippocampal+slice+cultures.">Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures.</a> Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).</li><li>Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+perfusion+chamber+for+the+study+of+nervous+tissue+slices+in+vitro.">A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).</li><li>Poulton, T. J., Ellingson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure+associated+with+induction+of+anesthesia+with+isoflurane.">Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane.</a> Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).</li><li>Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine+controls+prolonged+status+epilepticus.">Ketamine controls prolonged status epilepticus.</a> Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).</li><li>DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructure+of+the+neocortex:+comparative+aspects.">Microstructure of the neocortex: comparative aspects.</a> Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).</li><li>Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+correlates+of+two+frequently+observed+temporal+lobe+seizure-onset+patterns.">Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns.</a> Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).</li><li>Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+gephyrin+scaffolds+and+synaptic+strength+at+mature+hippocampal+GABAergic+postsynapses.">Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses.</a> Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).</li><li>Kirmse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+depolarizes+immature+neurons+and+inhibits+network+activity+in+the+neonatal+neocortex+in+vivo.">GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo.</a> Nature Communications. 6, 7750 (2015).</li><li>Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., H&#252;bner, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+KCl+cotransporter+KCC2+parallels+neuronal+maturation+and+the+emergence+of+low+intracellular+chloride.">Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride.</a> Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).</li><li>Wong, B. Y., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lateral+spread+of+ictal+discharges+in+neocortical+brain+slices.">The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices.</a> Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).</li><li>Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+propagation+of+epileptiform+activity:+evidence+for+an+inhibitory+veto+in+neocortex.">Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).</li><li>Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+inhibits+edema+in+brain+slices.">Ascorbate inhibits edema in brain slices.</a> Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).</li><li>MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEPES+prevents+edema+in+rat+brain+slices.">HEPES prevents edema in rat brain slices.</a> Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+Application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Patch-clamp Methods and Protocols. , 221-242 (2014).</li><li>Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure-like+events+in+brain+slices:+suppression+by+interictal+activity.">Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity.</a> Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).</li><li>Lees, G., St&#246;hr, T., Errington, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+effects+of+the+novel+anticonvulsant+lacosamide+against+4-AP+induced+epileptiform+activity+in+rat+visual+cortex+in+vitro.">Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro.</a> Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).</li></ol>

As fatias do cérebro são tratadas com uma droga proconvulsant ou um perfusato ACSF alterado para aumentar a excitabilidade da rede neural e promover uma precipitação de estável eventos (electrographic apreensão-como). Para os ratos, as fatias coronais preferenciais da área somatossensorial-motor devem conter o córtex cingulado, área 2 (CG), mas não a área de retrosplenial (RS); estes marcadores anatômicos ajudam a identificar a gama de fatias coronais que são melhores para induzir eventos estável. Uma modif...

Modelos de convulsão aguda com êxito podem reproduzir electrographic assinaturas reminiscentes de eventos estável observados no eletroencefalograma (EEG) de indivíduos tendo uma convulsão. Os pesquisadores utilizam esses eventos como estável (aqui referidos como 'eventos estável') como substitutos para a apreensão de evento1. Clinicamente, estável eventos servem como um proxy confiável para eventos de apreensão desde convulsões são um transtorno neurológico que se origina no cérebro. Na unidade de monitorização de epilepsia, neurologistas dependem a detecção de eventos estável para confirmar eletrofisiolÃ região do cérebro e isolá-lo para ressecção2. Em unidade de terapia intensiva, os médicos monitoram atividade estável para avaliar se alguma atividade de apreensão persiste em pacientes sedado3. Controlar convulsões continua a ser uma questão desafiadora para a comunidade médica, como 30% dos pacientes de epilepsia são resistentes aos medicamentos, a medicação disponível4,5, e 10% dos casos médicos envolvendo convulsões induzidas por drogas são Não responde ao tratamento padrão3. Isto apresenta uma preocupação séria para a sociedade, como 10% da população americana é prospectado para experimentar um evento de apreensão em sua vida e 3% são esperados para desenvolver epilepsia6.
Estudando as apreensões em modelos de epilepsia crônica é caro, trabalhoso e muitas vezes levar meses para preparar a7. É também difícil de executar gravações eletrofisiológicas em animais movimentando-se livremente. Ensaios clínicos humanos enfrentam problemas semelhantes, bem como as complexidades adicionais relacionadas com o consentimento do paciente, variabilidade nas origens dos participantes e as considerações morais e éticas envolvidas8. Modelos de convulsão aguda, por outro lado, são favoráveis, porque eles são relativamente conveniente para preparar, custo-eficiente e capaz de gerar grandes volumes de eventos estável para estudo9. Além disso, o tecido é fixo em uma posição estável, assim que as condições são ideais para a realização das gravações eletrofisiológicas necessárias para estudar a dinâmica de apreensão e a fisiopatologia subjacente relacionada. Modelos de convulsão aguda permanecem favoráveis sobre modelos em silico (computador), porque eles são baseados no material biológico composto de rede neuronal constituintes do cérebro com todos os seus factores inerentes e conectividade sináptica, que não pode ser capturada por computador até os mais detalhado modelos10. Estas características fazem modelos de convulsão aguda preparados para ser eficiente na triagem para potenciais anti-apreensão terapias e fazer conclusões preliminares antes de avançá-los para maiores investigações em modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos.
Normalmente, modelos de convulsão aguda são derivados do tecido cerebral normal que tenha sido submetido a condições hiperexcitável. Para induzir eventos estável clinicamente relevantes no tecido cerebral saudável, é importante compreender que o cérebro funciona otimamente em um estado crítico11 onde (E) de excitação e inibição (I) são equilibradas12. Uma interrupção do E-eu balanço pode levar ao estado de hiperexcitável apreensão em que precipitam eventos estável. Da mesma forma, dentro deste quadro conceptual, há duas estratégias principais para gerar eventos estável em fatias de cérebro (em vitro) ou em preparações todo-cérebro (na vivo): diminuição da inibição ("desinibição") ou aumentada excitação ("não-desinibição"). No entanto, eventos estável são altamente ordenados e sincronizado eventos que exigem a influência dos interneurônios gabaérgica para orquestrar a rede neural atividade13,14. Por esta razão, não-desinibição modelos são os mais eficazes para gerar eventos estável em redes neurais isolados, como em um em vitro cérebro fatia15, Considerando que em vitro modelos desinibição comumente levam a picos de atividade reminiscência de interictais como cravação. Além disso, dentro deste quadro conceptual, um evento de sincronização momentâneo confiável também pode desencadear um evento estável16. Na verdade, um evento estável pode ser desencadeado por qualquer pequena perturbação aplicada ao sistema neural17 quando está em um estado crítico de transição ("bifurcação") ponto18. Tradicionalmente, estas perturbações foram induzidas por estimulação elétrica. No entanto, o recente desenvolvimento de optogenetics em neurociência, oferece agora uma estratégia mais elegante para induzir transições de estado crítico16.
Os métodos descritos neste artigo demonstram como gerar eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda para tanto in vitro (etapa 1 do protocolo) e na vivo estudos (etapa 2 do protocolo). Eles envolvem a escolha da região do cérebro, método de indução de convulsões, tipo de estudo e espécie; no entanto, o foco será sobre a escolha recomendada de um modelo de apreensão de cortical aguda 4-AP devido à sua versatilidade em uma grande variedade de tipos de estudo. O modelo 4-AP convulsão aguda em vitro é baseado no protocolo padrão para preparar fatias de cérebro de alta qualidade para gravações eletrofisiológicas e19estudos de imagiologia. Esses protocolos já tem sido usados para fazer em vitro coronal do cérebro fatias de córtex somatossensorial-motor de ratos16,20 e humanos21. Modificações para gerar eventos estável nestes tipos de fatias do cérebro tenham sido demonstradas anteriormente16 e os detalhes são descritos no protocolo abaixo. O modelo 4-AP cortical convulsão aguda na vivo é baseado no protocolo padrão para preparar uma craniotomia para estudos22de imagem. A modificação é que nenhuma janela (lâmina de vidro) é instalada após a craniotomia. Em vez disso, agentes proconvulsant (4-AP) são topicamente aplicados ao córtex exposto para induzir eventos estável, enquanto o animal está sob anestesia geral. A nosso conhecimento, nosso grupo foi o primeiro a desenvolver este modelo de apreensão cortical aguda na vivo em camundongos16,23. O modelo 4-AP cortical convulsão aguda na vivo preparado a partir de ratos adultos foi desenvolvido para complementar o modelo in vitro fatia do tecido juvenil. A replicação das conclusões no modelo de apreensão adulto na vivo contribui para generalizar os resultados de modelos de fatia, abordando as preocupações inerentes sobre as condições de não-fisiológica de uma fatia do cérebro 2D (contra um 3D todo-cérebro estrutura) e as diferenças fisiológicas entre jovens e adulto de tecido.
O método de início de evento estável sob demanda é demonstrado usando ou sopros de neurotransmissores com uma estratégias de picospritzer ou optogenetic. O melhor de nosso conhecimento, nosso grupo é a primeira a iniciar eventos estável em tecido humano usando neurotransmissores através de um picospritzer16. Estratégias de optogenetic, a cepa de camundongos C57BL/6 é a tensão convencional usada para expressar transgenes. A expressão de channelrhodopsin-2 (ChR2) em interneurônios gabaérgica ou células piramidais glutamatérgico irá fornecer a capacidade opcional para gerar eventos estável on-demand com breves pulsos de luz. Cepas de ratos optogenetic adequado incluem a variante C57BL/6 comercialmente disponível que expressa ChR2 em qualquer interneurônios, usando o rato vesicular GABA transportador promotor (VGAT)24, ou células piramidais, usando o antígeno da pilha do mouse Timo 1 promotor (Thy1)25. Estes ratos VGAT-ChR2 e Thy1-ChR2 comercialmente disponíveis oferecem a oportunidade de ativar os neurônios gabaérgica ou neurônios glutamatérgico, respectivamente, no neocórtex com azul (470 nm) luz. A capacidade de gerar eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda pode oferecer novas oportunidades para estudar a dinâmica de iniciação de apreensão e eficientemente avaliar potenciais terapias anti-apreensão.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through the Toronto Western Hospital&#39;s Suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm syringe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 5/8&#8221; sterile needle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge razor blade (2x)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant adhesive glue</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish (2x)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter forceps (2x)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC handle micro spatula</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spoon with flat end</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detailing brush 5/0</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purcahsed from a boutique art store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide bore transfer pipette</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Tweezer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer (digital)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased on Amazon.ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through the Toronto Western Hospital&#39;s Suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through the Toronto Western Hospital&#39;s Suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)&#160;</td>
			<td>Scientific Systems Design Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4&#183;H2O)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2&#183;2H2O)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased through UT Med Store</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and on-demand initiation of acute ictal activity in rodent and human tissue

Controlar convulsões permanece uma questão desafiadora para a comunidade médica. Para progredir, pesquisadores precisam de uma maneira extensivamente estudar a dinâmica de apreensão e investigar seus mecanismos subjacentes. Modelos de convulsão aguda são convenientes, oferecem a capacidade de realizar gravações eletrofisiológicas e podem gerar um grande volume de electrographic apreensão, como de eventos (estável). Os resultados promissores de modelos de convulsão aguda então podem ser avançados para modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos. Assim, estudar convulsões em modelos agudas que reproduzem fielmente as assinaturas electrographic e dinâmicas de uma convulsão clínica será essencial para fazer achados clinicamente relevantes. Estudar eventos estável em convulsão aguda modelos preparados a partir de tecido humano também é importante para fazer descobertas que são clinicamente relevantes. O foco principal deste artigo é sobre o modelo 4-AP cortical devido a sua versatilidade em gerar eventos estável em estudos tanto in vivo e in vitro , bem como em rato e tecido humano. Os métodos neste artigo também irão descrever um método alternativo de indução de convulsões, usando o modelo2 + Zero-Mg e fornecer uma visão geral detalhada das vantagens e limitações da atividade epileptiforme semelhantes gerados em diferentes aguda modelos de apreensão. Além disso, aproveitando comercialmente disponível optogenetic cepas de rato, um pulso de luz breve (30 ms) pode ser usado para acionar um evento estável idêntico àqueles que ocorrem espontaneamente. Da mesma forma, 30-100 ms sopros de neurotransmissores (ácido gama-Amino butírico ou glutamato) podem ser aplicados para o tecido humano para acionar eventos estável que são idênticos aos que ocorrem espontaneamente. A capacidade de desencadear eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda oferece a recém-descoberta capacidade de observar a sequência exata dos eventos que dão suporte à dinâmica de iniciação de apreensão e com eficiência, avaliar potenciais terapias anti-apreensão.

A aplicação de 100 µM 4-AP para (sem danos) 450 fatias de cérebro cortical µm de tamanho boa qualidade de um juvenil VGAT-ChR2 rato induzido confiável estável eventos recorrentes (> 5 s) dentro de 15 min (Figura 1Ai). A aplicação de 100 µM 4-AP para fatias de má qualidade resultou na ruptura eventos ou spiking atividade (Figura 1Aii). Em média, 40% das fatias de cada cérebro de rato dissecado gerado com êxito evento...

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Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue

Modelos de convulsão aguda são importantes para estudar os mecanismos subjacentes epileptiforme eventos. Além disso, a capacidade de gerar eventos epileptiforme sob demanda fornece um método altamente eficiente para estudar a sequência exata de eventos subjacentes a sua iniciação. Aqui, descrevemos os modelos de apreensão cortical aguda 4-aminopiridina estabelecidos em mouse e tecido humano.

Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no estudo de mecanismos de apreensão, como, como, quais subpopulações neurais são responsáveis pelo início e término da convulsão eletrográfica. A principal vantagem dessa técnica, é que ela pode reproduzir eventos de convulsão eletrográfica, sob demanda, e modelos in vivo e in vitro que lembram os observados clinicamente. Esta técnica também pode ser usada para procurar potenciais terapias anticonvulsivas, tentando desencadear eventos de convulsão eletrográfica durante a aplicação de diferentes candidatos a medicamentos anticonvulsivos.Para preparar as fatias corticais, cole o tecido cerebral pré-clínico no estágio Vibratome, usando cola adesiva instantânea. Coloque suavemente o suporte de especimin na bandeja de buffer. Assegure-se de que a parte dorsal do cérebro está virada para a lâmina do Vibratome.Corte o cérebro em seções de 450 micrômetros de espessura, na direção dorsal para ventral. Faça o primeiro corte no cérebro animal pré-clínico para remover a lâmpada olfativa. Em seguida, faça cortes subsequentes até que a área motora somatosensorial seja observada.Use uma pipeta larga. Transfira as fatias coronais direcionadas para uma placa de Petrie contendo solução de dissecção a frio. Para as fatias coronais, faça um corte transversal logo abaixo da comissura neo cortical, e, em seguida, corte na linha média para separar os hemisférios.Em seguida, use uma nova lâmina de barbear para cortar qualquer excesso de tecido das fatias. É fundamental realizar o procedimento de corte cerebral de forma eficiente. Cada momento que o tecido cerebral não está submerso no ACSF, é prejudicial à sua qualidade.Tecido cerebral danificado e de baixa qualidade é menos provável que gere eventos de convulsão eletrográfica. Transfira a porção dorsal das fatias coronais, que contêm o córtex neo, para uma segunda placa de Petrie preenchida com 35 graus Celsius ACSF, por um momento. Em seguida, transfira prontamente as fatias para uma câmara de incubação, contendo 35 graus Celsius carbogenado ACSF.Deixe as fatias cerebrais ligeiramente submersas na câmara de incubação a 35 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, retire a câmara de incubação do banho de água e permita que ela volte à temperatura ambiente. Espere uma hora para que as fatias cerebrais se recuperem, antes de realizar gravações eletrofisiológicas.Neste procedimento, corte o papel da lente que é ligeiramente maior que a fatia cerebral. Use uma pipeta de furo largo ou um pincel de detalhamento para transferir uma fatia cerebral para o papel da lente recortado que é mantido no lugar usando uma pinça dentária. Em seguida, transfira o papel da lente com uma fatia cerebral para a câmara de gravação, e fixá-lo em posição com uma tela de harpa.Posteriormente, profuse a fatia cerebral na câmara de gravação com ACSF carbogenado a 35 graus Celsius a uma taxa de três mililitros por minuto. Use um termômetro digital para garantir que a câmara de gravação seja de 33 a 36 graus Celsius. Em seguida, enchimento de vidro com 10 microliters de ACSF, usando uma seringa Hamilton.Sob o estereóquio 20 vezes, guie o eletrodo de vidro de gravação para a camada cortical superficial, dois, três, usando manipuladores manuais. Veja a atividade elétrica da fatia cerebral com software padrão. Para induzir atividades de convulsão eletrográfica, profuse a fatia cerebral com ACSF contendo 4-AP a 100 micromolar.Veja a atividade elétrica da fatia cerebral com software padrão. Para gerar eventos semelhantes a convulsões eletrográficas, utilizando estratégia optogenética nas fatias cerebrais de camundongos optogenéticos, use um manipulador manual para posicionar uma fibra óptica de 1.000 mícrons de diâmetro do cabo diretamente acima da região de gravação. Aplique um breve pulso de luz azul para iniciar um evento ictal.Um programa baseado em MATLAB foi desenvolvido especificamente para detectar e classificar os vários tipos de eventos epilépticos que ocorrem nos modelos de apreensão in vitro e in vivo 4-AP. Este programa de detecção está disponível no repositório Do Valiante Labs GitHub. A aplicação de 100 micromolar 4-AP para uma boa qualidade 450 mícrons de tamanho cortical fatias cerebrais de um rato de canal VGAT juvenil, induziu de forma confiável eventos recorrentes semelhantes a ictal dentro de 15 minutos.A aplicação de 100 micromolar 4-AP em fatias de má qualidade, resultou em eventos de estouro ou atividade de espirro. Em média, 40% das fatias de cada cérebro pré-clínico dissecado, geraram eventos semelhantes a ictal com sucesso. Além disso, 83% dos camundongos dissecados resultaram em pelo menos uma fatia cerebral que gerou eventos semelhantes a ictal com sucesso.Em fatias cerebrais com eventos semelhantes a ictal de ocorrência espontânea, a aplicação de um breve pulso de luz de 30 milissegundos na fatia cerebral, desencadeou de forma confiável um evento semelhante a ictal que era idêntico na morfologia. As mesmas descobertas foram feitas em fatias cerebrais de Thy one Channelrhodopsin dois ratos. Assim, independentemente de qual subpopulação neuronal foi ativada, qualquer breve evento sincronizador na rede neural cortical isolada, levou ao início de um evento semelhante a ictal.Estes eventos semelhantes a ictal eram compostos de um pico sentinela, disparos tônicos, disparos clonicos e atividade semelhante a explosão no final. Eram de natureza semelhante às assinaturas eletrográficas associadas a convulsões clínicas. Após esse procedimento, outros tipos de transições de estado cerebral podem ser realizadas para abordar questões como, quais são os mecanismos neurobi biologicamente subjacentes às transições do estado cerebral?E como podemos regular essas transições para evitar a entrada em vários estados cerebrais patológicos?

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Neurociência

Measuring Circadian and Acute Light Responses in Mice using Wheel Running Activity

Medição Responses Luz circadianos e aguda em ratos usando Atividade Roda Executando

Circadian rhythms are physiological functions that cycle over a period of approximately 24 hours (circadian- circa: approximate and diem: day)1, 2.  They ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Imagem Pheromone Sensing em um Preparação Slice rato Vomeronasal aguda do tecido

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Registro e análise dos ritmos circadianos em Running rodas Atividade em Roedores

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...