Analysera Protein arkitekturer och Protein-Ligand komplex av integrativ strukturella masspektrometri

Numera masspektrometri spelar en viktig roll i strukturbiologi. Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor om viktiga biologiska makromolekyler i sitt hemland, särskilt proteiner och proteinkomplex. Native masspektrometri är allmänt tillämplig på en mängd olika biomolekylära församlingar inklusive multiprotein och nukleinsyra system.

Den största fördelen med denna teknik är att det är snabbt och mycket känslig. Det kan användas för att förhöra heterogena proteinprover, gör det möjligt att analysera flera proteiner i oligomeriskt tillstånd samtidigt. Demonstrera förfarandet kommer andy Lau, en doktorand i min grupp.

För att påbörja detta förfarande, förbereda in-house kapillärerna för nanoelektrospray som beskrivs i textprotokollet. Förbered ett ligandfritt prov som en kontroll för varje körning som buffertutbyte var och en till ammoniumacetat. Därefter väljer du lägen för känslighet, positiv jonanskaffning och mobilitets-TOF- lägen.

Nästa sväng på fällan, API, och IMS gaser. För IM-avskiljning använd de kväve- och argonstartpunkter som visas här och justera vid behov. Ställ in ett lämpligt m/z-förvärvsintervall.

För ett okänt protein de inledande optimeringsstegen bör använda ett brett spektrum. Sätt in den guldbelagda kapillären i en kapillärhållare. Ladda sedan mellan två och tre mikroliter av proteinkomplexlösningen av intresse in i kapillären.

Dra försiktigt åt kapillären och placera den på elektrosprayens källstadium. Skjut scenen i position för att börja förvärva data. Applicera ett lågt gastryck med nanoflöde tills en droppe bildas vid kapillärens spets.

Flytta kapillären med avseende på konen och övervaka jonströmmen för att uppnå en stabil jonström. Applicera en kapillärspänning i intervallet mellan 0,9 och 1,6 kilovolt. Ställ sedan in provtagningskonen, källförskjutningen, källtemperaturen och kongasflödet enligt textprotokollet.

För att förvärva ett väl löst massspektrum och maximerad jonöverföring, justera MS-parametrarna och övervaka den resulterande förändringen i spektra. Ställ in fällans kollisionsenergi på en första startpunkt mellan 10 och 50 volt. Om spänningsförskjutningarna är otillräckliga, justera fällans kollisionsenergier.

Ställ in fällan via dess spänning till en inledande utgångspunkt mellan 20 och 45 volt. Förbättra desolvation genom att optimera denna spänning. Efter detta optimerar du våghastigheten och våghöjden enligt textens konturer för att uppnå bästa rörlighetsseparation.

För studier som omfattar HerA och NurA använda en våghastighet på 40 meter per sekund och en våghöjd mellan 550 och 650 volt. För DNA-bindningsanalys, blanda proteinet och DNA vid ett molarförhållande som möjliggör protein-DNA-komplexbildning. Tillsätt ökande mängder av något av följande, 5'O-3-thio-triphosphate, tetralitium salt, eller ADP.

Använda lämplig programvara mäta massorna av genererade arter och identifiera ligand bindningen, såsom ATP och ADP bindande och oligomeric stater. Använd sedan de jonintensiteter som observerats i den råa ESI MS-spektra för att kvantifiera motsvarande relativa förekomst av arter. Efter att ha optimerat instrumentförhållandena för stabil transmission, minska kollisionsenergin och provtagningskonen så låg som möjligt, samtidigt som du fortfarande behåller god spektrakvalitet.

Använd den tidigare fastställda optimerade våghastigheten och våghöjden för att förvärva IM MS. Mät jondrifttiden vid tre olika vågsvedder samtidigt som du behåller samma våghöjd. För att bestämma proteinjonen CCS mäter fyra proteinkalibbranter, två med massan ovanför det protein som är under utredning och två med massan nedan, med samma instrumentationsförhållanden. Först förbereda proteinprover och buffert utbyta dem i ammoniumacetat som beskrivs i textprotokollet.

Tillsätt lösningsmedel i 10%steg tills den når önskad mängd. Inkubera på is i en timme. Efter detta, skaffa ett IM-MS-spektrum för varje prov.

Använda programvaran SUMMIT, tilldela protein subkomplex och generera nätverk protein interaktion. Alternativt generera manuellt en lista över teoretiska massor för den förväntade arten. För att börja undersöka proteinkomplex stabilitet, registrera IM-MS data samtidigt öka fällan acceleration spänning från 10 volt till 200 volt, som successivt kommer att utvecklas till proteinet och gasfasen.

Analysera data med hjälp av lämplig programvara och generera tvådimensionella utspelningsritar genom att stapla intensiteten normaliserade CCS-fördelningar vid varje accelererande spänning för varje laddningstillstånd. Native MS-resultaten avslöjar oligomeric tillstånd, sammansättning och topologi av HerA och NurA komplexa. Som noncovalent interaktioner bevaras i gasfasen, native MS av ATP gamma S och ADP titrering experiment, används för att bestämma par-vis nukleotid bindning i HerA och NurA.

Massspektra av de HerA oligomeric staterna avslöjar att öka ATP gamma S koncentrationen ökar den relativa intensiteten av hexameric HerA. De experimentella CCS-värdena för proteinerna och deras komplex härleds sedan från IM-MS-experimenten. Dessa värden ses ha god överenskommelse med teoretiska mätningar från röntgenkristallografi, som validerar med hjälp av CCS-värden för att bygga lågupplösta modeller av proteinmontering.

CIU och KEcom analys visar att DNA bundna HerA-NurA är mer stabil än DNA-fria komplex. CIU MS-analys och respektive ATP-bindningstillstånd visar att det fyra atp gamma S-bundet tillståndet minskar komplex stabilitet i gasfasen. Men de sex ATP gamma S bundna tillstånd där alla platser är ockuperade, ses vara den mest stabila.

Noggranna mätningar av den molekylära massan av ett intakt komplex ger värdefull insikt i biomolekylär karakterisering. Vi kan få information om komplexa monteringsvägar, protein oligomerisering, och ligand bindning. Kombinera all denna information gör det möjligt att generera detaljerade modeller av funktionella biologiska församlingar.