Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

ونود أن نشكر "الرابطة من أجل le neurogénétique de la التنمية" للدكتور جاككوير للزمالات وفؤاد-الحفل الخيري لدعمها من خلال الخطة الاستراتيجية ميونيورالب. كما نود أن نشكر الدكتور كريس هندرسون، الدكتور وليام Camu والدكتور بريجيت بيتمان، الدكتور سيدريك راؤول والدكتور جورج هاس، الذين شاركوا في تطوير وتحسين هذه التقنية ونشر هذه المعرفة.

وقبلت اللجنة الأخلاقية التابعة للمؤسسة كافة الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات.
1-حل إعداد
<ol><li>إعداد 10 مل من 4% دياليزيد جيش صرب البوسنة في المتوسط L-15.<ol>
<li>حل مسحوق ألبومين المصل البقري في 4% (w/v) في 10 مل من L-15 المتوسطة.</li>
		<li>إضافة الحل إلى كاسيت الغسيل الكلوي 20 مل مع وقف كاتشي...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

واحدة من النقاط الحرجة في هذا البروتوكول أن يتم تشريح الأجنة الماوس في إطار زمني دقيق خلال التنمية (E12.5) لتحسين مقدار MNs تم الحصول عليها في النهاية. وبالإضافة إلى ذلك، للعائد الأمثل، ينبغي إجراء التشريح في الصباح أو بعد الظهر. قبل E12.5 (مثلاً، في E11.5)، تشريح الصعبة، لا سيما فيما يتعلق بالق...

الأمراض العصبية العضلية تشمل مجموعة متنوعة من الأمراض سريرياً ووراثيا المتميزة التي تتميز بها تحوير العضلات و/أو الجهاز العصبي. وقد حددت مئات جينات المسؤولة عن هذه الاضطرابات النادرة بسبب التقدم في تكنولوجيا التسلسل، خلال العقد الماضي (قائمة متوفرة في مركز الأمراض نيوروموسكولار، http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). مجموعة متنوعة الطفرات التي تم تحديدها ويشير إلى أن الطفرات المختلفة في جين واحد يمكن أن يسبب تعمل المختلفة والأمراض1،،من23 والتي يمكن أن تنتج الطفرات في جينات مختلفة تعمل مماثلة 4 , 5-وفي هذا السياق، هناك جهود تبذل لتطوير نماذج الخلوية التي يمكن أن تصبح أدوات قوية لتحليل آثار الطفرة والآليات المرضية.
MNs العمود الفقري لديها اتفاقات كبيرة تقع في قرون البطني الحبل الشوكي، شكل محاور عصبية طويلة لاستهداف ألياف العضلات الهيكلية، وتسمح بالانتقال الطوعي من خلال إطلاق سراح أستيل في الوصلات العصبية العضلية. ولما MNs تتأثر بأمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي، شاركو-ماري الأسنان المرض (CMT)، وضمور العضلات الشوكي، والدكتور هندرسون والزملاء وضع البروتوكول الأول6 يسمح بزراعة في المختبر MNs العمود الفقري واكتشاف نيوروتروفيك عامل جدنف7 (الخلية الدبقية مشتقة من نيوروتروفيك عامل). مكنت التحسينات التقنية منذ ذلك الحين لتنقية أكثر دقة MNs العمود الفقري والأنواع الفرعية الخاصة بها باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية8، ولكن يظل الإثراء بالتدرج كثافة قوية والمستخدمة على نطاق واسع في المختبرات التي تعمل حاليا مع MNs العمود الفقري الأولية 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14-وفي وقت لاحق، من الممكن أيضا الحصول على أعلى درجة تنقية مينيسوتا عن طريق إيمونوبانينج بالاستفادة من السطح علامة p75(NTR)15،،من1617.
الحبل الشوكي يحتوي على أنواع فرعية مختلفة من MNs عنق الرحم والصدر وأسفل الظهر، فضلا عن الأعمدة موتور الوسطية والجانبية التي تختلف باختلاف مواقعها في القرن الأمامي على محور دورسو البطني ومن بين الأهداف التي يعصب8، 18-"مينيسوتا الأساسي" الثقافات يمكن استرداد كافة هذه الأنواع الفرعية مينيسوتا في نسب الفسيولوجية. القيد الرئيسي من هذا الأسلوب هو انخفاض عدد MNs تم الحصول عليها في نهاية الإجراء؛ في الواقع، فإنه يمكن توقع الحصول على حوالي 105 MNs من الأجنة الستة، ومناسبة للفحص المجهري ولكن الحد لتجارب الكيمياء الحيوية. للقيام بتجارب مع أكثر فرعية موحدة ووفرة MNs (> 106 خلايا)، الجنينية المستمدة من الخلايا الجذعية MNs ينبغي النظر في18.
تعداء المتسلسلات البرية-نوع/المسخ أو الجينات الذاتية ضربة قاضية إلى MNs الرئيسي أداة سريعة ومفيدة لفك رموز مسارات فيسيوباثولوجيكال، لا سيما عندما لا تتوفر نماذج الماوس. ماجنيتوفيكشن أسلوب واحد للعصبية الأولية ترانسفيكتينج، شبيه ليبوفيكشن دون السمية العصبية ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تعداء على الخلايا العصبية الناضجة بعد عدة أيام في المختبر، خلافا لتقنيات استناداً إلى انهانسر9. ومع ذلك، عيب واحد من هذه التقنية أن الخرز ربط الأحماض النووية في الثقافة، تسبب الضوضاء في وسم DAPI. العدوى الفيروسية المرجح هو الأسلوب الأكثر كفاءة ل MNs ترانسفيكتينج؛ ومع ذلك، لا يتطلب ماجنيتوفيكتيون بعض إجراءات السلامة اللازمة لإنتاج الفيروسية والعدوى الخلوية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

نيوروديجينيريشن موتونيورونس العمود الفقري (MNs) المتورطة في طائفة واسعة من اضطرابات عصبية، بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي ومرض شاركو-ماري الأسنان وضمور العضلات الشوكي، التي ترتبط كلها بضمور العضلات. الثقافات الأولية للعمود الفقري MNs استخدمت على نطاق واسع لإثبات تورط جينات محددة في مثل هذه الأمراض، وتميز بالآثار المترتبة على الطفرات الخلوية. هذا البروتوكول نماذج مينيسوتا أساسي الثقافة المستمدة من العمل المنوي هندرسون والزملاء منذ أكثر من عشرين عاماً. أولاً، أننا بالتفصيل طريقة تشريح قرون الأمامي من الحبل الشوكي من جنينا ماوس وعزل MNs من الخلايا باستخدام تدرج كثافة المجاورة. ثم، فإننا نقدم طريقة جديدة لكفاءة ترانسفيكتينج MNs مع البلازميدات التعبير باستخدام ماجنيتوفيكشن. أخيرا، نحن لتوضيح كيفية إصلاح وإيمونوستين الابتدائي MNs. استخدام الطفرات نيوروفيلامينت التي تسبب-شاركو ماري الأسنان المرض نوع 2، هذا البروتوكول يوضح نهجاً نوعيا للتعبير عن البروتينات للفائدة وتدرس مشاركتها في النمو MN، والصيانة، والبقاء على قيد الحياة.

بعد 24 ساعة في الثقافة، إبداء موتونيورونس (MNs) الفعل النمو محواري كبيرة (على الأقل 6 مرات أطول من حجم سوما). وفي الأيام التالية، محاور عصبية وينبغي أن تواصل نموها وعرض التفريع (الشكل 2). سوف يكون هناك مورفولوجيس مختلفة نظراً لخصوصيات النوع الفرعي. على سبيل الم?...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

والهدف من هذا الأسلوب إعداد ثقافة موتونيورونس الأولية (MNs) من الحبل الشوكي مورين التخصيب. لتقييم آثار الطفرات التي تسبب الأمراض مينيسوتا، يصف لنا هنا معزولة عزل هذه MNs وما تعداء من ماجنيتوفيكشن.

النمذجة شاركو-ماري الأسنان المرض في المختبر من قبل ترانسفيكتينج موتونيورونس الابتدائي الماوس

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب، مثل قطبية الخلايا العصبية الحركية، والتوجيه المحوري، والاتجار بمحور عصبي، وآليات التنكس العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو الحصول على ثقافة الخلايا العصبية الحركية المخصب للغاية في حين أننا نأخذ للتعبير عن البروتين لدينا ضربة قاضية من قبل المودة دقيقة. لبدء هذا الإجراء، ضع جنينًا واحدًا في طبق من وسائل التشريح المرمزة بالسيليكون.تحت المجهر، عقد الجنين مع البطن ضد السيليكون مع ملقط. مع الزوج الثاني من ملقط، أدخل واحدة من النصائح في القناة المركزية للنخاع الشوكي. ثم، إغلاق ملقط لتمزيق الأنسجة الظهرية قليلا.كرر هذه العملية نحو الجانب كونيل حتى يتم فتح الحبل الشوكي بأكمله. بعد ذلك، ضع الجنين بحيث يكون الحبل الشوكي المفتوح ضد السيليكون. في وقت لاحق، فصل الجزء من العمود الفقري من الجسم.قرصة الجزء من الحبل الشوكي، وسحب الجنين من الرأس لاستخراج الحبل الشوكي. سحب بعناية بعيدا أي السحايا المتبقية وDDGs لا تزال تعلق على الحبل الشوكي. قم بتسطيح الحبل الشوكي على السيليكون واستخدام مشرط، وإزالة نصف الظهر من الحبل بقطع على طول منتصف كل جانب.قطع الجزء الأوسط إلى عشر قطع، ونقلها إلى أنبوب جديد. لإعداد تعليق خلايا النخاع الشوكي، قم بجمع قطع الحبل الشوكي في الجزء السفلي من الأنبوب. استبدال HBSS مع ملليلتر واحد من لحم الخنزير F-10 المتوسطة وإضافة عشرة ميكرولترات من التربسين.احتضان الأنبوب لمدة عشر دقائق في 37 درجة مئوية. لوقف الهضم الأنزيمي، نقل الشظايا إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر، تحتوي على 800 ميكرولتر من كامل L-15 المتوسطة، 100 ميكرولترات من 4٪ BSA، و 100 ميكرولترات من DNAs و titrate، مرتين. دع الشظايا تستقر لمدة دقيقتين قبل جمع المابير في أنبوب 15 ملليلتر جديد.أضف برفق مليلترين من 4٪ BSA في الجزء السفلي من الأنبوب الفائق. سينترو يصهرها عند 470 x جاذبية لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق، وإزالة عظمى وإعادة تعليق البليت الخلية مع 2 ملليلتر من متوسطة L-15 كاملة.لإثراء موتونيورون، تقسيم تعليق الخلية إلى اثنين من أنابيب 15 ملليلتر. ثم، إضافة ملليلتر اثنين من L-15 PH المتوسطة لكل أنبوب. إذا بدأت بستة أجنة، استخدم ما يعادل ثلاثة أجنة لكل أنبوب، وثلاثة ملليلترات متوسطة.إضافة ببطء 2 ملليلتر من حل الكثافة gradience، إلى الجزء السفلي من كل أنبوب للحصول على واجهة حادة. بعد ذلك، سينترو الصمامات في 830 × الجاذبية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذه الخطوة، يجب أن تكون الخلايا الصغيرة في الجزء السفلي من الأنبوب، في حين أن الخلايا الكبيرة مثل motoneuron- ينبغي أن تكون في حل التدرج الكثافة/ واجهة متوسطة.Asperae 1 إلى 2 ملليلتر من الخلايا في واجهة ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر الطازجة. ضبط مستوى الصوت إلى عشرة ملليلترات مع L-15 PH المتوسطة. في وقت لاحق، إضافة ملليلتر اثنين من وسادة BSA 4٪ إلى الجزء السفلي من الأنابيب اثنين.ويندمج سنترو عند 470 × الجاذبية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 5 دقائق، وإزالة عظمى وإعادة تعليق البليت و 3 ملليلتر من متوسطة L-15 كاملة. كرر الذبذبة المركزية عند 470 × الجاذبية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.ثم، إزالة الفائقة وإعادة تعليق البليت الخلية ومليلتر اثنين من ثقافة كاملة المتوسطة. لثقافة الخلايا العصبية الحركية، تمييع لهم إلى 5، 000-10، 000 الخلايا في 500 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة في بئر في لوحة 24 جيدا. ثم، إزالة حل laminae مع في P-1، 000 تلميح pipet.نقل الخلايا العصبية الحركية على الفور المخفف في وسط الثقافة. إلى لوحات الترميز لتجنب التجفيف. لإعداد الحمض النووي، إعادة تعليق 1 ميكروغرام من الحمض النووي في 50 ميكرولترات من متوسطة الثقافة العصبية.ودوامة لمدة 5 ثوان. لإعداد أنبوب B، إعادة تعليق 1.5 ميكرولترات من الخرز في 50 ميكرولترات من متوسطة ثقافة الخلايا العصبية. أضف 50 ميكرولترات من محلول الخرز إلى 50 ميكرولترات من محلول الحمض النووي وحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.خلال هذا الحضانة، سحب 100 ميكرولترات من الوسط الثقافة من البئر التي سيتم نقل العدوى. في وقت لاحق، نقل 100 ميكرولترات من مزيج حبة الحمض النووي إلى كل بئر. واحتضان لوحة 24 جيدا، 20-30 دقيقة على لوحة المغناطيسي في 37 درجة مئوية.هو مبين هنا، هو مورفولوجيا الخلايا العصبية المودم كشفت عن طريق الوقوف من سلسلة العصبية غير الفوسفورية غير ذاتية الثقيلة بعد أربعة أيام من الثقافة. في هذه الصور، وتظهر مورفولوجيا الخلايا العصبية المودم بعد أربعة أيام في المختبر وtransfected للجينة عبر EGFP عن طريق المغنطيسة في اليوم الثاني. وكانت الخلايا العصبية شعار مضادة ملطخة مع علامة SMI-32 أو علامة عموم العصبية TUJ-1 والسهام تشير إلى سوما من الخلايا العصبية.هذه هي صورها confocal من الخلايا العصبية الحركية المصابة المغنطيسية، والتعبير عن نوع البرية أو متحولة EGFP NEFH ثوابت وملطخة لعلامة autophagic LC-3B. الأسهم تظهر مجاميع البروتين EGFP NEFH متحولة التي هي أيضا LC-3B إيجابية بعد هذا الإجراء، montoholda curcha يمكن تحليلها عن طريق المجهر الفيديو لتصور الاتجار بمحور المحاور وإضافة بعض التوجيهات. بعد تطورها الأولي لمعالجة الأسئلة الأساسية في علم الأحياء العصبية ، تثبت هذه التقنية أيضًا أنها أداة قوية لاستكشاف الآليات المرضية الفيزيوية التي تورط طيف اضطرابات ال موتونيورون ، مثل مرض متلازمة الصدمة السامة ، التصلب الجانبي السام ، أو ضمور العضلات الشوكي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

الكشف عن لوحات لالتهاب الأعصاب في مرض ألزهايمر النموذجي ماوس

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectin القائم على عزل وثقافة حركية مماثلة الجنينية الماوس

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

في المختبر نمذجة السرطانية العصبية الغزو: وظهري الجذر العقدة نموذج

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

النمذجة السكتة الدماغية في الفئران: الآفات القشرية البؤرية عن طريق Photothrombosis

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...