Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Vi vil gerne takke den "Association pour le développement de la neurogénétique" Dr. Jacquier fellowship og AFM-Telethon for dets støtte gennem MyoNeurAlp strategiske plan. Vi vil også gerne takke Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul og Dr. Georg Haase, der deltog i udvikling og forbedring af teknik og sprede deres viden.

Alle procedurer, der involverer dyr blev accepteret af det etiske udvalg af institutionen.
1. løsning forberedelse
<ol><li>Forberede 10 mL 4% BSA dialysebehandling i L-15 medium.<ol>
<li>Opløse bovint serumalbumin pulver på 4% (w/v) i 10 mL af L-15 medium.</li>
		<li>Føje løsningen til en 20 mL dialyse kassette med 20 kDa afskæring. Dialyze mod 500 mL af L-15 medium i 3 dage under agitation ved 4 ° C. Ændre L-15 medium hver dag.</li>
		<li>Filtreres gennem et 0,22 µm membran og alik...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

En af de kritiske punkter i denne protokol er at mus embryoner er dissekeret på en præcis tidsvindue under udvikling (E12.5) til at optimere størrelsen af MNs opnået ved afslutningen. For optimal udbytte, skal der desuden udføres et dissektion, i morgen eller tidligt på eftermiddagen. Før E12.5 (f.eks. på E11.5) er dissektion svært, især med hensyn til afskaffelse af meninges. Efter E12.5 falder antallet af opnåede MNs markant. For at styre embryo udviklingstrin, voksne hunner og hanner er første gan...

Neuromuskulære sygdomme omfatter en række klinisk, og genetisk forskellige patologier, der er karakteriseret ved ændring af muskel og/eller nervesystemet. På grund af fremskridt i sekventering teknologier, hundredvis af gener ansvarlige for disse sjældne sygdomme er blevet identificeret i det sidste årti (liste findes på Neuromuscular sygdom Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Forskellige identificerede mutationer angiver at forskellige mutationer i et enkelt gen kan forårsage forskellige fænotyper og sygdomme1,2,3 og at mutationer i forskellige gener kan producere tilsvarende fænotyper 4 , 5. i denne sammenhæng, der er bestræbelser på at udvikle cellulære modeller, der kan blive stærke redskaber til at analysere mutation konsekvenser og patologiske mekanismer.
Spinal MNs har store svovldepositioner i de ventrale horn af rygmarven, form lang axons at målrette skelet muskelfibre, og gøre det muligt for frivillige bevægelser gennem frigivelse af acetylcholin i neuromuskulære vejkryds. Da MNs påvirkes af neuromuskulære sygdomme som Amyotrofisk lateral sklerose, udviklet Charcot-Marie-Tooth sygdom (CMT), og spinal muskelatrofi, Dr. Henderson og kolleger den første protokol6 , der er tilladt for dyrkning af in vitro- spinal MNs og opdagelsen af neurotrope faktor GDNF7 (glial celle afledte neurotrope faktor). Tekniske forbedringer siden da har tilladt for mere præcise rensning af spinal MNs og deres undertyper bruger FACS8, men tilsætning af tæthed farveforløb forbliver stærk og udbredt i laboratorier, der i øjeblikket arbejder med primære spinal MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. efterfølgende, det er også muligt at opnå en højere MN rensning grade gennem immunopanning ved at udnytte overflade markør p75(NTR)15,16,17.
Rygmarven indeholder forskellige undertyper af livmoderhalskræft, torakal og lumbal MNs samt median og laterale motor kolonner, der adskiller sig blandt deres placering i den forreste horn på en dorso-ventrale akse og blandt mål, der innerverer de8, 18. primære MN kulturer kan inddrive alle disse MN undertyper i fysiologiske proportioner. Den største begrænsning af denne teknik er det lave antal MNs opnået ved afslutningen af proceduren; i virkeligheden, kan det forventes at få omkring 105 MNs fra seks embryoner, som er egnet til mikroskopi men begrænsende for biokemi eksperimenter. At udføre eksperimenter med mere standardiserede undertyper og rigelige MNs (> 106 celler), embryonale stamceller-afledt MNs bør overvejes18.
Transfektion af wild-type/mutant transgener eller knockdown endogene gener i primære MNs er en hurtig og nyttigt værktøj til afkodning physiopathological veje, især når musen modeller er ikke tilgængelig. Magnetofection er en teknik til transfecting primære neuroner, svarende til lipofection uden den relaterede neurotoksicitet. Derudover kan Transfektion udføres på modne neuroner efter flere dage i vitro, i modsætning til teknik baseret på elektroporation9. En ulempe ved denne teknik er imidlertid at perlerne binde nukleinsyrer i kultur, forårsager støj i DAPI mærkning. Virusinfektion er sandsynligvis den mest effektive teknik til transfecting MNs; magnetofection kræver dog ikke visse sikkerhedsprocedurer, der er nødvendige til fremstilling af viral og cellulær infektion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Neurodegeneration af spinal motoneurons (MNs) er impliceret i et stort spektrum af neurologiske lidelser herunder Amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sygdom og spinal muskelatrofi, som er alle forbundet med muskelsvind. Primære kulturer af spinal MNs har været anvendes bredt til at dokumentere inddragelse af specifikke gener i sådanne sygdomme og karakterisere de cellulære konsekvenser af deres mutationer. Denne protokol modeller en primær MN kultur stammer fra den skelsættende arbejde af Henderson og kolleger mere end tyve år siden. Først, vi detalje en metode til at dissekere de forreste horn af rygmarven fra en mus Foster og isolere MNs fra tilstødende celler ved hjælp af en tæthed farveforløb. Derefter, vi præsenterer en ny måde at effektivt transfecting MNs med udtryk plasmider ved hjælp af magnetofection. Endelig vil illustrere vi hvor hen til lave og immunostain primære MNs. ved hjælp af neurofilament mutationer, der forårsager Charcot-Marie-Tooth sygdom type 2, denne protokol viser en kvalitativ tilgang til at udtrykke proteiner af interesse og studere deres inddragelse i MN vækst, vedligeholdelse og overlevelse.

Efter 24 timer i kulturen vise motoneurons (MNs) allerede betydelige cytoskeletale vækst (mindst 6 gange længere end soma størrelsen). I de følgende dage, bør axoner fortsætte med at vokse og vise forgrening (figur 2). Der vil være forskellige morfologier på grund af subtype specificiteter. For eksempel, median kolonne MNs, der innerverer aksiale muskler har kortere og mere forgrenet axoner end laterale motor kolonne MNs, der innerverer lemmer muskler...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Målet med denne teknik er at forberede en yderst højberiget kultur af primær motoneurons (MNs) fra murine rygmarven. For at vurdere konsekvenserne af mutationer forårsager MN sygdomme, vi beskriver her isolation af disse isolerede MNs og deres Transfektion af magnetofection.

Modellering Charcot-Marie-Tooth sygdom In Vitro af Transfecting musen primære Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Denne metode kan bidrage til at løse centrale spørgsmål i neurobiologi, såsom motor neuron polaritet, axon vejledning, axon handel, og neurodegenerative mekanismer. Den største fordel ved denne teknik er at opnå en højt beriget motor neuron kultur, mens vi tager for at udtrykke vores knockdown protein ved minut hengivenhed. For at begynde denne procedure, placere et foster i en skål af dissektion medier kodet med silicium.Under mikroskopet skal du holde fosteret med maven mod silicium med syr. Med det andet par stænde, indsætte en af de tips i den centrale kanal rostrad rygmarven. Luk derefter stætrene for at rive dorsalvævet en smule.Gentag denne operation mod connell side, indtil hele rygmarven er åbnet. Dernæst placere fosteret, så den åbne rygmarv er imod silicium. Derefter frigøre rostrad del af rygmarven fra kroppen.Klem rostrad del af rygmarven, og træk fosteret ved hovedet for at udtrække rygmarven. Træk forsigtigt eventuelle resterende meninges og DRGs stadig er knyttet til rygmarven. Flade rygmarven på silicium og ved hjælp af en skalpel, fjerne rygskøjlen halvdelen af ledningen ved at skære langs midten af hver side.Skær den midterste del i ti stykker, og overføre dem til et nyt rør. For at forberede rygmarvscelleaffjedring, indsamle rygmarvsstykker i bunden af røret. Udskift HBSS med en milliliter Ham F-10 medium og tilsæt ti mikroliter trypsin.Inkuber røret i ti minutter ved 37 grader Celsius. For at stoppe den enzymatiske fordøjelse overføres fragmenterne til et nyt 15 milliliterrør, der indeholder 800 mikroliter komplet L-15-medium, 100 mikroliter på 4% BSA og 100 mikroliter DNAs og titrere to gange. Lad fragmenterne nøjes i to minutter, før supernatanten opsamler i et friskt 15 milliliterrør.Tilsæt forsigtigt to milliliter 4% BSA i bunden af supernatantrøret. Centro smelter den ved 470 x tyngdekraft i 5 minutter. Efter 5 minutter fjernes supernatanten, og cellepallen skal hænges igen med 2 milliliter komplet L-15-medium.For motoneuron berigelse opdeles cellesuspensionen i to 15 milliliterrør. Derefter tilsættes to milliliter L-15 PH medium til hvert rør. Hvis der startes med seks embryoner, skal der anvendes, hvad der svarer til tre embryoner pr. rør, og tre milliliter medium.Tilsæt langsomt 2 milliliter tæthedsgradopløsning til bunden af hvert rør for at opnå en skarp grænseflade. Dernæst centro smelte det ved 830 x tyngdekraft i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter dette trin, bør små celler være i bunden af røret, mens store celler-såsom motoneuron-bør være på tætheden gradient løsning / medium interface.Asperae 1 til 2 milliliter af cellerne ved grænsefladen og overføre dem til en frisk 15 milliliter rør. Juster lydstyrken til ti milliliter med L-15 PH-medium. Derefter tilsættes to milliliter af 4% BSA puden til bunden af de to rør.Og centro sikring ved 470 x tyngdekraft i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter 5 minutter fjernes supernatanten og pallen og 3 milliliter komplet L-15-medium indstilles igen. Centrfugaten gentages ved 470 x tyngdekraft i 5 minutter ved stuetemperatur.Fjern derefter supernatanten, og ophæng derefter cellepallen igen og to milliliter komplet kulturmedium. Til kultur motor neuroner, fortynde dem til 5, 000-10, 000 celler i 500 mikroliter af kultur medium per brønd i en 24 brønd plade. Fjern derefter laminae opløsningen med ved P-1, 000 pipet spidsen.Straks overføre motor neuroner fortyndet i kultur medium. kodningspladerne for at undgå tørring. For at forberede DNA, re-suspendere 1 mikrogram DNA i 50 mikroliter af neuronal kultur medium.Og vortex i 5 sekunder. For at forberede B-røret skal du re-suspendere 1,5 mikroliter af perler i 50 mikroliter af neuronal kulturmedium. Der tilsættes 50 mikroliter perleopløsning til 50 mikroliter DNA-opløsning og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.Under denne inkubation trækkes 100 mikroliter af dyrkningsmediet ud af brønden, som vil blive transficeret. Efterfølgende overføres 100 mikroliter af DNA-perleblandingen til hver brønd. Og inkuber den 24 brøndplade, 20-30 minutter på magnetpladen ved 37 grader Celsius.Vist her, er modem neuron morfologi afsløret ved stående af endogene ikke-fosforyleret neurofilament tunge kæde efter fire dages kultur. I disse billeder, vise modem neuron morfologi efter fire dage in vitro og transfected for EGFP trans gen ved magnetofection på dag to. Motto neuroner blev kontrafarvet med markøren SMI-32 eller pan-neuro markør TUJ-1 og pilene angiver soma af neuroner.Disse er deres konfokale billeder af magneto inficerede motor neuroner, der udtrykker vilde type eller mutant EGFP NEFH konstruktioner og farves for deres autophagic markør LC-3B. Pile viser den mutante EGFP NEFH protein aggregater, der også er LC-3B positive Efter denne procedure, montoholda curcha kan analyseres ved video mikroskopi til at visualisere axon handel og tilføje nogle retningslinjer. Efter sin indledende udvikling til at løse grundlæggende spørgsmål i neuralbiologi, denne teknik også vise sig at være et effektivt redskab til at udforske fysio patologiske mekanismer implicerer spektret af motoneuron lidelser, såsom toksisk chok syndrom sygdom, samuel trofisk lateral sklerose, eller spinal muskelatrofi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Påvisning af Microregional Hypoxia i mus hjernebarken ved to-foton Imaging af endogent NADH Fluorescens

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In vitro Modellering af Kræft Neural Invasion: Dorsal rodganglie Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modeling Neuronal død og Degeneration i musen primære cerebellare granulet neuroner

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering og Isolation af musen primære mikroglia ved tæthed Gradient centrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Hurtig og specifik Immunomagnetic Isolation af musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal differentiering fra mus embryonale stamceller In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Modellering Slagtilfælde i mus: Focal Cortical Læsioner af photothrombosis

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...