Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

We zouden graag bedanken de "Association pour le développement de la neurogénétique" voor Dr. Jacquier de fellowship en AFM-Telethon voor zijn steun via MyoNeurAlp strategisch plan. Wij zouden ook willen bedanken Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul en Dr. Georg Haase, die deelgenomen aan de ontwikkeling en verbetering van de techniek en de verspreiding van hun kennis.

Alle procedures waarbij dieren werden aanvaard door de ethische commissie van de instelling.
1. oplossing voorbereiding
<ol><li>10 mL van 4% BSA dialyzed in L-15 medium voor te bereiden.<ol>
<li>Los bovien serumalbumine poeder op 4% (m/v) in 10 mL L-15 voedingsbodem.</li>
		<li>Voeg de oplossing op een 20 mL dialyse cassette met een 20 kDa cut-off. Dialyze tegen 500 mL L-15 voedingsbodem voor 3 dagen onder agitatie bij 4 ° C. Het veranderen van het medium van de L-15 elke dag.</li>
		<li>Fi...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

Eén van de kritieke punten in dit protocol is dat de muis embryo's worden ontleed bij het venster van een precieze tijd tijdens de ontwikkeling (E12.5) voor het optimaliseren van de hoeveelheid MNs bekomen op het einde. Bovendien, voor optimale opbrengst, moet de dissectie worden uitgevoerd in de ochtend of vroeg in de middag. Voor E12.5 (bijvoorbeeld op E11.5) is dissectie moeilijk, vooral met betrekking tot de afschaffing van de hersenvliezen. Na E12.5 daalt het aantal verkregen MNs aanzienlijk. Om te control...

Neuromusculaire ziekten omvatten een scala aan klinisch en genetisch verschillende aandoeningen die worden gekenmerkt door de verandering van de spier en/of het zenuwstelsel. Vanwege de vooruitgang in sequencing technologieën, honderden genen die verantwoordelijk zijn voor deze zeldzame aandoeningen zijn vastgesteld tijdens het laatste decennium (lijst beschikbaar op de neuromusculaire ziekte Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). De verscheidenheid van geïdentificeerde mutaties geeft aan dat er verschillende mutaties in een enkel gen leiden verschillende fenotypes en ziekten1,2,3 tot kunnen en dat mutaties in verschillende genen soortgelijke fenotypen kunnen produceren 4 , 5. in dit verband zijn er inspanningen voor de ontwikkeling van cellulaire modellen die krachtige hulpmiddelen voor het analyseren van de gevolgen van de mutatie en pathologische mechanismen kunnen worden.
Spinale MNs hebben grote Soma gelegen in de ventrale hoorns van het ruggenmerg, formulier lange axons te richten skelet spiervezels en voor vrijwillige bewegingen door het vrijkomen van acetylcholine bij neuromusculaire kruisingen. Aangezien MNs worden beïnvloed door neuromusculaire ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth (CMT), en spinale musculaire atrofie, Dr Henderson en collega's ontwikkelde de eerste protocol6 , dat is toegestaan voor de teelt van in vitro spinale MNs en de ontdekking van neurotrophic factor GDNF7 (gliale cel afgeleide neurotrophic factor). Technische verfijningen sindsdien hebben toegestaan voor nauwkeuriger zuivering van spinale MNs en de bijbehorende subtypen FACS8gebruikt, maar verrijking door dichtheid verloop blijft krachtige en meest gebruikte in laboratoria die momenteel werken met primaire spinale MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. vervolgens is het ook mogelijk te krijgen een hogere rang van MN zuivering door middel van immunopanning door gebruik te maken van oppervlakte marker p75(NTR)15,16,17.
Het ruggenmerg bevat verschillende subtypen van cervicale, thoracale en lumbale MNs, evenals met mediaan en lateraal motor kolommen die verschilt van de vindplaats in de voorste hoorn op een dorso-ventrale as en de doelen onderling innervate ze8, 18. primaire MN culturen kunnen herstellen alle van deze subtypen MN in fysiologische verhoudingen. De belangrijkste beperking van deze techniek is het geringe aantal MNs bekomen op het einde van de procedure; in feite, kan worden verwacht te verkrijgen rond 105 MNs zes embryo's, die is geschikt voor microscopie maar voor Biochemie experimenten te beperken. Voor het uitvoeren van experimenten met meer gestandaardiseerde subtypen en overvloedige MNs (> 106 cellen), embryonale stamcel afkomstige MNs18moeten worden beschouwd.
De transfectie van wild-type/mutant transgenen of vechtpartij endogene genen in primaire MNs is een snelle en nuttig hulpmiddel voor het ontcijferen van de pathofysiologische trajecten, met name wanneer Muismodellen niet beschikbaar zijn. Magnetofection is een techniek voor transfecting primaire neuronen, vergelijkbaar met lipofection zonder de verwante neurotoxiciteit. Bovendien kan transfectie worden uitgevoerd op volwassen neuronen na verschillende dagen in vitro, in tegenstelling tot de technieken op basis van electroporation9. Een nadeel van deze techniek is echter dat de kralen nucleïnezuren in de cultuur binden, waardoor ruis in de DAPI labeling. Virale infectie is waarschijnlijk de meest efficiënte techniek voor transfecting MNs; magnetofection vereist echter geen bepaalde veiligheidsprocedures die nodig is voor virale productie en cellulaire infectie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Neurodegeneratie van spinale motoneurons (MNs) is betrokken bij een groot spectrum van neurologische stoornissen zoals Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth en spinale musculaire atrofie, die allen geassocieerd met atrofie van de spieren. Primaire culturen van spinale MNs zijn wijd gebruikt om blijk te geven van de betrokkenheid van specifieke genen in dergelijke ziekten en karakteriseren van de cellulaire gevolgen van hun mutaties. Dit protocol modellen een primaire MN cultuur is afgeleid van het baanbrekende werk van Henderson en collega's meer dan twintig jaar geleden. Ten eerste, we detail een methode voor het ontleden van de voorste hoorns van het ruggenmerg van het embryo van een muis en het isoleren van de MNs van naburige cellen met behulp van een dichtheid verloop. Vervolgens presenteren we een nieuwe manier van efficiënt transfecting MNs met expressie plasmiden met behulp van magnetofection. Tot slot, we illustreren hoe op te lossen en immunokleuring primaire MNs. met behulp van neurofilament mutaties die leiden type 2 ziekte Charcot-Marie-Tooth tot, dit protocol toont aan een kwalitatieve benadering van uiten van proteïnen van belang en het bestuderen van hun betrokkenheid bij MN groei, onderhoud en overleving.

Na 24 uur in de cultuur moeten worden motoneurons (MNs) al aanzienlijke axonale groei (ten minste 6 keer langer dan de grootte van het soma) weergegeven. In de volgende dagen, moeten axonen blijven groeien en weergeven van vertakkende (Figuur 2). Er zullen verschillende morphologies als gevolg van subtype specifieke kenmerken. Mediane kolom MNs die axiale spieren innervate hebben bijvoorbeeld korter en meer vertakt axonen dan laterale motor kolom MNs die lede...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Het doel van deze techniek is om voor te bereiden een hoogverrijkt cultuur van primaire motoneurons (MNs) van lymfkliertest ruggenmerg. Om te beoordelen van de gevolgen van mutaties veroorzaakt MN ziekten, beschrijven we hier het isolement van deze geïsoleerd MNs en hun transfectie door magnetofection.

Modelleren ziekte van Charcot-Marie-Tooth In Vitro door muis primaire Motoneurons Transfecting

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de neurobiologie aan te pakken, zoals motorneuron polariteit, axon begeleiding, axon handel, en neurodegeneratieve mechanismen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het verkrijgen van een sterk verrijkte motorische neuron cultuur, terwijl we nemen om onze knockdown eiwit uit te drukken door minuut genegenheid. Om deze procedure te beginnen, plaats een embryo in een schotel van dissectie media gecodeerd met silicium.Houd het embryo met de buik met tangen onder de microscoop tegen het silicium. Met het tweede paar tangen plaatst u een van de uiteinden in het centrale kanaal van het rostrad ruggenmerg. Sluit vervolgens de tangen om het rugweefsel iets te scheuren.Herhaal deze operatie naar de connell kant totdat het hele ruggenmerg wordt geopend. Plaats vervolgens het embryo zo dat het open ruggenmerg tegen het silicium is. Maak vervolgens het rostrad-deel van het ruggenmerg los van het lichaam.Knijp het rostrad deel van het ruggenmerg, en trek het embryo door het hoofd om het ruggenmerg te halen. Trek voorzichtig alle resterende hersenvliezen en DRGs weg die nog aan het ruggenmerg zijn bevestigd. Plat het ruggenmerg op het silicium en met behulp van een scalpel, verwijder de rughelft van het koord door te snijden langs het midden van elke kant.Snijd het middelste deel in tien stukken, en breng ze naar een nieuwe buis. Ter voorbereiding van ruggenmergs cel suspensie, het verzamelen van de dwarslaesie aan de onderkant van de buis. Vervang HBSS door een milliliter Ham F-10 medium en voeg tien microliter trypsine toe.Broed de buis tien minuten in bij 37 graden Celsius. Om de enzymatische spijsvertering te stoppen, breng de fragmenten over naar een nieuwe buis van 15 milliliter, met 800 microliter van volledig L-15-medium, 100 microliter van 4%BSA en 100 microliter DNAs en titrate, twee maal. Laat de fragmenten twee minuten rusten voordat u de supernatant in een verse buis van 15 milliliter verzamelt.Voeg voorzichtig twee milliliter van 4%BSA aan de onderkant van de supernatant buis. Centro zekering het op 470 x zwaartekracht gedurende 5 minuten. Verwijder na 5 minuten de supernatant en hang de celpallet opnieuw op met 2 milliliter compleet L-15-medium.Voor motoneuron verrijking, split de cel suspensie in twee 15 milliliter buizen. Voeg vervolgens twee milliliter L-15 PH-medium toe aan elke buis. Gebruik het equivalent van drie embryo's per buis en drie milliliter medium als u begint met zes embryo's.Voeg langzaam 2 milliliter dichtheidgradience oplossing, aan de onderkant van elke buis om een scherpe interface te verkrijgen. Vervolgens, centro zekering het op 830 x zwaartekracht gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Na deze stap moeten kleine cellen zich aan de onderkant van de buis bevinden, terwijl grote cellen, zoals de motoneuron-, op de dichtheidsgradiëntoplossing/medium interface moeten zijn.Asperae 1 tot 2 milliliter van de cellen op de interface en breng ze naar een verse 15 milliliter buis. Pas het volume aan op tien milliliter met L-15 PH-medium. Voeg vervolgens twee milliliter van het 4%BSA-kussen toe aan de onderkant van de twee buizen.En centro zekering op 470 x zwaartekracht gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na 5 minuten de supernatant en hang de pallet en 3 milliliter van volledig L-15-medium opnieuw op. Herhaal de centrifugate bij 470 x zwaartekracht gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens de supernatant en hang de celpallet en twee milliliter van volledig kweekmedium opnieuw op. Om motorische neuronen te kweken, verdun ze tot 5.000-10.000 cellen in 500 microliter van cultuurmedium per put in een 24 putplaat. Verwijder vervolgens de laminaeoplossing met P-1,000 pipetpunt.Breng onmiddellijk de motorneuronen verdund in kweekmedium. aan de coderingsplaten om te voorkomen dat ze worden gedroogd. Om DNA voor te bereiden, schorst u opnieuw 1 microgram DNA in 50 microliter van neuronale kweekmedium.En vortex voor 5 seconden. Om de B-buis voor te bereiden, schort u opnieuw 1,5 microliter kralen van kralen op in 50 microliter van neuronale kweekmedium. Voeg 50 microliter kraaloplossing toe aan 50 microliter DNA-oplossing en incubbate gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Tijdens deze incubatie, trekken 100 microliters van cultuurmedium uit de put die zal worden doorsneden. Breng vervolgens 100 microliter van de DNA-kraalmix naar elke put. En broed de 24 put plaat, 20-30 minuten op de magnetische plaat op 37 graden Celsius.Hier getoond, is de modem neuron morfologie geopenbaard door het staan van endogene niet-fosforyleerde neurofilament zware keten na vier dagen van cultuur. In deze beelden, tonen de modem neuron morfologie na vier dagen in vitro en doorgetransfecteerd voor EGFP trans gen door magnetofection op dag twee. Motto neuronen waren tegen-gekleurd met de marker SMI-32 of de pan-neuro marker TUJ-1 en de pijlen geven de soma van de neuronen.Dit zijn hun confocale beelden van magneto fected motorneuronen, uitdrukken wilde type of mutant EGFP NEFH constructies en gekleurd voor hun autophagic marker LC-3B. Pijlen tonen de gemuteerde EGFP NEFH eiwit aggregaten die ook LC-3B positief zijn Volgens deze procedure kan montoholda curcha worden geanalyseerd door videomicroscopie om axonhandel te visualiseren en wat begeleiding toe te voegen. Na de eerste ontwikkeling om fundamentele vragen in de neurale biologie aan te pakken, blijkt deze techniek ook een krachtig hulpmiddel om fysiopathologische mechanismen te onderzoeken die het spectrum van motoneuronaandoeningen impliceren, zoals de ziekte van het toxische shocksyndroom, samuel trophic laterale sclerose of spinale musculaire atrofie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Detectie van neuritische plaques in de ziekte van Alzheimer Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modellering van kanker zoals Neurale Invasion: De dorsale wortel ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Modelleerslag bij muizen: focale corticale laesies door fototrombose

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...