Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Nous tenons à remercier le « Association pour le développement de la neurogénétique » du Dr Jacquier bourse et AFM-Telethon pour son aide au moyen de MyoNeurAlp plan stratégique. Nous tenons aussi à remercier Dr Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr Brigitte Pettmann, Dr Cedric Raoul et Dr. Georg Haase, qui a participé à l’élaboration et l’amélioration de la technique et de diffuser leurs connaissances.

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été acceptées par le Comité d’éthique de l’institution.
1. préparation de la solution
<ol><li>Préparer 10 mL de 4 % BSA dialysée dans un milieu L-15.<ol>
<li>Dissoudre la poudre de l’albumine sérique bovine à 4 % (p/v) dans 10 mL de milieu de L-15.</li>
		<li>Ajouter la solution d’une cassette de dialyse de 20 mL avec un cut-off 20 kDa. Dialyser contre 500 mL de milieu de L-15 pendant 3 jours sous agitation à 4 ° C. Change...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

Un des points critiques de ce protocole est que les embryons de souris sont disséqués à une fenêtre de temps précis au cours du développement (E12.5) afin d’optimiser la quantité de MNs obtenus à la fin. En outre, pour un rendement optimal, la dissection doit être effectuée le matin ou tôt dans l’après-midi. Avant E12.5 (par exemple, à E11.5), la dissection est difficile, surtout en ce qui concerne l’élimination des méninges. Après E12.5, le nombre de MNs obtenus diminue significativement. ...

Maladies neuromusculaires englobent une variété de pathologies cliniquement et génétiquement distinctes qui sont caractérisées par l’altération du muscle ou le système nerveux. En raison des progrès dans les technologies de séquençage, des centaines de gènes responsables de ces maladies rares ont été identifiées au cours de la dernière décennie (liste disponible à le Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La variété des mutations identifiées indique que différentes mutations dans un gène unique peuvent provoquer différents phénotypes et maladies1,2,3 et que les mutations dans les gènes différents peuvent produire des phénotypes semblables 4 , 5. dans ce contexte, il y a des efforts pour développer des modèles cellulaires qui peuvent devenir de puissants outils pour analyser les conséquences de la mutation et de mécanismes pathologiques.
La colonne vertébrale MNs ont grands somas situés dans les cornes ventrales de la moelle épinière, les axones longs forme afin de cibler les fibres musculaires squelettiques et permettre des mouvements volontaires par le biais de la libération d’acétylcholine au niveau des jonctions neuromusculaires. Étant donné que les MNs sont affectés par des maladies neuromusculaires comme la sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) et l’atrophie musculaire spinale, Dr Henderson et ses collègues ont mis au point le premier protocole6 qui a permis à la culture de in vitro MNs de la colonne vertébrale et la découverte de neurotrophic factor GDNF7 (facteur neurotrophique dérivé de cellules gliales). Perfectionnements techniques depuis lors ont permis pour la purification plus précise de MNs de la colonne vertébrale et leurs sous-types utilisant FACS8, mais l’enrichissement par gradient de densité reste puissant et largement utilisé dans les laboratoires travaillent actuellement avec primaires MNs de la colonne vertébrale 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. par la suite, il est également possible d’obtenir un grade supérieur de purification MN par immunopanning en profitant du marqueur de surface p75(NTR)15,16,17.
La moelle épinière contient différents sous-types de MNs cervicales, thoraciques et lombaires, ainsi que des colonnes moteurs médians et latéraux qui varient selon leur situation dans la corne antérieure sur un axe dorso-ventral et parmi les cibles qu’ils innervent8, 18. les cultures primaires MN peuvent récupérer toutes ces sous-types de MN dans des proportions physiologiques. La principale limite de cette technique est le faible nombre de MNs obtenus à la fin de la procédure ; en fait, on peut s’attendre à obtenir environ 105 MNs de six embryons, qui convient pour la microscopie, mais limite pour des expériences de biochimie. D’effectuer des expériences avec plus standardisés sous-types et MNs abondantes (> 106 cellules), embryonnaire cellules souches dérivées MNs il faudrait18.
Transfection de sauvage-type/mutant transgènes ou gènes endogènes défiant dans MNs primaires est un outil rapid et utile pour décrypter les voies physiopathologiques, surtout quand les modèles de souris ne sont pas disponibles. Magnétofection est une technique pour la transfection neurones primaires, semblables à lipofection sans la neurotoxicité connexe. En outre, transfection peut être réalisée sur les neurones matures après plusieurs jours in vitro, à la différence des techniques basées sur l’électroporation9. Cependant, un inconvénient de cette technique est que les perles lient les acides nucléiques dans la culture, provoquant des bruits par marquage au DAPI. Infection virale est probablement la technique la plus efficace pour transfectant MNs ; Toutefois, magnétofection ne nécessite pas de certaines procédures de sécurité nécessaires à la production virale et cellulaire infection.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Neurodégénérescence des motoneurones spinaux (MNs) est impliquée dans un large éventail de troubles neurologiques comme la sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth et amyotrophie spinale, qui sont tous associés à une atrophie musculaire. Les cultures primaires de MNs de la colonne vertébrale ont été largement utilisés pour démontrer l’implication des gènes spécifiques à ces maladies et de caractériser les conséquences cellulaires de leurs mutations. Cette culture de modèles une MN premier protocole dérivé de l’ouvrage fondateur de Henderson et ses collègues il y a plus de vingt ans. Tout d’abord, nous détaillons une méthode de dissection des cornes antérieures de la moelle épinière d’un embryon de souris et isoler la MNs de cellules à l’aide d’un gradient de densité voisines. Puis, nous présentons une nouvelle façon de transfectants efficacement MNs avec des plasmides d’expression à l’aide de magnétofection. Enfin, Nous illustrons comment réparer et réagissent primaire que mns. à l’aide des mutations de neurofilaments qui causent la maladie de Charcot-Marie-Tooth type 2, le présent protocole montre une approche qualitative pour exprimer les protéines d’intérêt et d’étudier leur implication dans Croissance de MN, entretien et la survie.

Après 24 heures dans la culture, motoneurones (MNs) devraient déjà montrer la croissance axonale significative (au moins 6 fois plus longue que la taille de soma). Dans les jours suivants, axones devraient continuer à croître et afficher la ramification (Figure 2). Il y aura différentes morphologies en raison des spécificités de sous-type. Par exemple, colonne médiane MNs qui innervent les muscles axiaux ont des axones plus courtes et plus ramifiés ...

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Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

L’objectif de cette technique consiste à préparer une culture fortement enrichie des motoneurones primaires (MNs) de moelle épinière murine. Afin d’évaluer les conséquences des mutations responsables de maladies MN, nous décrivons ici l’isolement de ces isolés MNs et leur transfection par magnétofection.

Maladie de Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro de modélisation par transfectants souris primaire motoneurones

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés en neurobiologie, telles que la polarité des motoneurones, la guidage des axones, le trafic d’axone et les mécanismes neurodégénératifs. Le principal avantage de cette technique est d’obtenir une culture hautement enrichie de neurones moteurs pendant que nous prenons pour exprimer notre protéine knockdown par affection minute. Pour commencer cette procédure, placez un embryon dans un plat de dissection média codé avec du silicium.Sous le microscope, tenir l’embryon avec l’abdomen contre le silicium avec des forceps. Avec la deuxième paire de forceps, insérez l’un des bouts dans le canal central de la moelle épinière rostrad. Ensuite, fermez les forceps pour déchirer légèrement le tissu dorsal.Répétez cette opération vers le côté connell jusqu’à ce que toute la moelle épinière soit ouverte. Ensuite, placez l’embryon de sorte que la moelle épinière ouverte est contre le silicium. Par la suite, détachez la partie rostrad de la moelle épinière du corps.Pincer la partie rostrad de la moelle épinière, et tirer l’embryon par la tête pour extraire la moelle épinière. Retirez soigneusement les méninges restantes et les DRG encore attachés à la moelle épinière. Aplatir la moelle épinière sur le silicium et à l’aide d’un scalpel, enlever la moitié dorsale de la moelle en coupant le long du milieu de chaque côté.Couper la partie centrale en dix morceaux et les transférer dans un nouveau tube. Pour préparer la suspension cellulaire de la moelle épinière, recueillir les morceaux de moelle épinière au fond du tube. Remplacer HBSS par un millilitre de jambon F-10 moyen et ajouter dix microlitres de trypsine.Incuber le tube pendant dix minutes à 37 degrés Celsius. Pour arrêter la digestion enzymatique, transférez les fragments dans un nouveau tube de 15 millilitres, contenant 800 microlitres de L-15 moyen complet, 100 microlitres de 4%BSA, et 100 microlitres d’ADN et titrisation, deux fois. Laissez les fragments se déposer pendant deux minutes avant de recueillir le surnatant dans un tube frais de 15 millilitres.Ajouter délicatement deux millilitres de 4%BSA au fond du tube supernatant. Centro le fusionner à 470 x gravité pendant 5 minutes. Après 5 minutes, retirer le supernatant et suspendre à nouveau la palette cellulaire avec 2 millilitres de L-15 moyen complet.Pour l’enrichissement de motoneuron, divisez la suspension cellulaire en deux tubes de 15 millilitres. Ajouter ensuite deux millilitres de L-15 PH moyen à chaque tube. Si vous commencez avec six embryons, utilisez l’équivalent de trois embryons par tube et de trois millilitres de milieu.Ajouter lentement 2 millilitres de solution de gradience de densité, au fond de chaque tube pour obtenir une interface nette. Ensuite, centro le fusionner à 830 x gravité pendant 15 minutes à température ambiante. Après cette étape, les petites cellules doivent être au fond du tube, tandis que les grosses cellules - comme le motoneuron - devraient être à la solution de gradient de densité/interface moyenne.Asperae 1 à 2 millilitres des cellules à l’interface et les transférer dans un tube frais de 15 millilitres. Réglez le volume à dix millilitres avec le milieu L-15 PH. Par la suite, ajouter deux millilitres du coussin 4%BSA au fond des deux tubes.Et le centro fusionne à 470 x gravité pendant 5 minutes à température ambiante. Après 5 minutes, retirer le supernatant et suspendre à nouveau la palette et 3 millilitres de L-15 moyen complet. Répétez le centrifugage à 470 x gravité pendant 5 minutes à température ambiante.Ensuite, retirez le supernatant et suspendez la palette cellulaire et deux millilitres de milieu de culture complet. Pour la culture des motoneurones, diluez-les à 5000-10 000 cellules dans 500 microlitres de milieu de culture par puits dans une plaque de puits de 24. Ensuite, retirez la solution laminae avec à la pointe P-1 000 pipet.Transférer immédiatement les neurones moteurs dilués dans le milieu de la culture. aux plaques de codage pour éviter le séchage. Pour préparer l’ADN, suspendre à nouveau 1 microgramme d’ADN dans 50 microlitres de milieu de culture neuronale.Et vortex pendant 5 secondes. Pour préparer le tube B, suspendre à nouveau 1,5 microlitres de perles dans 50 microlitres de milieu de culture neuronale. Ajouter 50 microlitres de solution perlée à 50 microlitres de solution d’ADN et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.Au cours de cette incubation, retirez 100 microlitres de milieu culturel du puits qui seront transfectés. Par la suite, transférez 100 microlitres du mélange de perles d’ADN à chaque puits. Et incuber la plaque de puits 24, 20-30 minutes sur la plaque magnétique à 37 degrés Celsius.Montré ici, est la morphologie de neurone de modem révélée par la position de la chaîne lourde endogène de neurofilament non phosphorylated après quatre jours de culture. Dans ces images, montrez la morphologie de neurone de modem après quatre jours in vitro et transfected pour le gène trans d’EGFP par magnétofection au deuxième jour. Les neurones de devise ont été contre-tachés avec le marqueur SMI-32 ou le marqueur pan-neuro TUJ-1 et les flèches indiquent le soma des neurones.Ce sont leurs images confocales de neurones moteurs magnéto fected, exprimant type sauvage ou mutant EGFP NEFH construit et taché pour leur marqueur autophagique LC-3B. Les flèches montrent les agrégats mutants de protéine d’EGFP NEFH qui sont également positifs de LC-3B Suivant cette procédure, la curcha de montoholda peut être analysée par microscopie vidéo pour visualiser le trafic d’axons et ajouter quelques conseils. Après son développement initial pour aborder des questions fondamentales en biologie neuronale, cette technique s’avère également être un outil puissant pour explorer les mécanismes pathologiques physio impliquant le spectre des désordres de motoneurone, tels que la maladie toxique de syndrome de choc, la sclérose latérale trophique samuelique, ou l’atrophie musculaire spinale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

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La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

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Recherche

Neurosciences

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Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

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Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

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