Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Wir möchten danken, der "Association pour le Développement De La Neurogénétique" für Dr. Jacquier Fellowship und AFM-Telethon für seine Unterstützung durch MyoNeurAlp Strategieplan. Wir möchten auch danke Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul und Dr. Georg Haase, die bei der Entwicklung und Verbesserung der Technik teilgenommen und ihr Wissen zu verbreiten.

Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Ethikkommission der Institution akzeptiert.
1. Vorbereitung der Lösung
<ol><li>Bereiten Sie 10 mL von 4 % BSA in L-15 Medium dialysiert.<ol>
<li>Rinderserumalbumin Pulver bei 4 % (w/V) in 10 mL des L-15 Mediums auflösen.</li>
		<li>Ergänzen Sie die Projektmappe, um eine 20 mL-Dialyse-Kassette mit einer 20 kDa Cutoff. Dialyse gegen 500 mL L-15 Medium für 3 Tage unter Unruhe bei 4 ° C. Verändern Sie das L-15 Medium jeden Tag.</li>
		<li>Filtern Si...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

Die kritischen Punkte in diesem Protokoll gehört, dass die Maus-Embryonen bei einem genauen Zeitfenster während der Entwicklung (E12.5), die Höhe der MNs erhalten am Ende zu optimieren seziert werden. Darüber hinaus sollte für optimalen Ertrag der Dissektion am Morgen oder in den frühen Nachmittag durchgeführt werden. Vor E12.5 (z. B. bei E11.5) ist Dissektion schwierig, insbesondere im Hinblick auf die Beseitigung von der Hirnhaut. Nach E12.5 sinkt die Anzahl der erhaltenen MNs deutlich. Um den Embryosta...

Neuromuskuläre Erkrankungen umfassen eine Vielzahl von klinisch und genetisch unterschiedlichen Pathologien, die durch die Veränderung von Muskel und/oder des Nervensystems gekennzeichnet sind. Aufgrund der Fortschritte in Sequenziertechnologien, Hunderte von Genen, die für diese seltenen Erkrankungen wurden während des letzten Jahrzehnts (Liste an Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Die Vielfalt der identifizierten Mutationen bedeutet, dass verschiedene Mutationen in einem einzelnen Gen verschiedene Phänotypen und Krankheiten1,2,3 verursachen können und Mutationen in verschiedenen Genen ähnliche Phänotypen erzeugen kann 4 , 5. in diesem Zusammenhang gibt es Bemühungen, zelluläre Modelle zu entwickeln, die leistungsfähige Werkzeuge für die Analyse von Mutation folgen und pathologischen Mechanismen werden kann.
Spinale MNs haben große Somas befindet sich in der ventralen Hörner des Rückenmarks, Form lange Axone Skelett-Muskelfasern und bewussten Bewegungen durch die Freisetzung von Acetylcholin an neuromuskulären Verbindungen ermöglichen. Da MNs von neuromuskulären Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Tooth-Erkrankung (CMT), betroffen sind und spinale Muskelatrophie, Dr. Henderson und Kollegen entwickelt das erste Protokoll6 , die für den Anbau von zulässig in-vitro- Wirbelsäule MNs und die Entdeckung von neurotrophen Faktor GDNF7 (Gliazelle abgeleiteten Neurotrophic Factor). Technische Raffinessen seitdem haben für eine genauere Reinigung von spinalen MNs und ihre Subtypen mit FACS8zugelassen, aber Anreicherung durch Dichtegradienten bleibt kräftig und weit verbreiteten im Labor arbeitet derzeit mit primärer spinaler MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. anschließend, es ist auch möglich, eine höhere Besoldungsgruppe von MN-Reinigung durch Immunopanning zu erhalten, unter Ausnutzung der Oberfläche Marker p75(NTR)15,16,17.
Das Rückenmark enthält verschiedene Subtypen des zervikalen, thorakalen und lumbalen MNs sowie mittlere und seitliche motor Spalten, die sich unter ihren Standort in der Vorderhornzellen auf einer Achse dorsal-Ventral unterscheiden und unter den Zielen sie innervieren8, 18. primäre MN Kulturen aller diese Subtypen MN in physiologischen Verhältnissen erholen können. Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist die geringe Anzahl von MNs erhalten am Ende des Verfahrens; in der Tat können voraussichtlich erhalten rund 105 MNs aus sechs Embryonen für Mikroskopie aber einschränkend für Biochemie Experimente geeignet ist. Experimente mit mehr standardisierte Subtypen und reichlich MNs durchführen (> 106 Zellen), embryonale Stammzellen abgeleitet MNs18betrachtet werden.
Transfektion von Wild-Typ/Mutant transgene oder Knockdown endogene Gene in primären MNs ist ein schnelles und hilfreiches Werkzeug für die Entschlüsselung pathophysiologischen Wege, vor allem, wenn Maus-Modellen nicht zur Verfügung stehen. Magnetofection ist eine Technik für transfecting primären Neuronen, ähnlich wie Lipofektion ohne die damit verbundenen Neurotoxizität. Darüber hinaus kann Transfektion auf Reife Neuronen nach mehreren Tagen in Vitro, im Gegensatz zu Techniken basierend auf Elektroporation9durchgeführt werden. Ein Nachteil dieser Technik ist jedoch, dass die Perlen in der Kultur, Lärm in DAPI-labeling Nukleinsäuren binden. Virale Infektion ist wahrscheinlich die effizienteste Technik für transfecting MNs; Magnetofection erfordert jedoch keine bestimmte Sicherheitsvorkehrungen für virale Produktions- und zelluläre Infektion benötigt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Neurodegeneration der spinalen Motoneurone (MNs) ist verwickelt in einem großen Spektrum von neurologischen Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit und spinale Muskelatrophie, die Muskelatrophie zugeordnet sind. Primärkulturen von spinalen MNs haben verbreitet zu demonstrieren die Beteiligung bestimmter Gene in solchen Krankheiten und charakterisieren die zellulären folgen deren Mutationen. Dieses Protokoll Modelle eine primäre MN Kultur abgeleitet von der bahnbrechenden Arbeit von Henderson und Kollegen vor mehr als zwanzig Jahren. Zuerst zeigen wir eine Methode der sezieren die vorderen Hörner des Rückenmarks aus einem Maus-Embryo und MNs aus benachbarten Zellen mit einem Dichtegradienten zu isolieren. Dann präsentieren wir Ihnen eine neue Art des effizient transfecting MNs mit Ausdruck Plasmide mit Magnetofection. Schließlich zeigen wir, wie Sie zu beheben und Immunostain primäre zeigt MNs. mit Neurofilament-Mutationen, die Charcot-Marie-Tooth-Krankheit Typ 2 verursachen, dieses Protokoll einen qualitativen Ansatz, mit dem Ausdruck interessierender Proteine und studieren ihre Beteiligung an MN-Wachstum, Wartung und überleben.

Nach 24 Stunden in der Kultur sollte Motoneurone (MNs) zeigen bereits erhebliches axonale Wachstum (mindestens 6 mal länger als die Soma-Größe). In den folgenden Tagen sollte Axone weiter wachsen und Verzweigung (Abbildung 2) angezeigt. Es werden unterschiedliche Morphologien durch Subtyp Besonderheiten. Zum Beispiel mittlere Spalte MNs, die axiale Muskeln innervieren haben kürzere und mehr verzweigten Axone als seitliche motor Spalte MNs, die Extremität...

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Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Das Ziel dieser Technik ist eine hoch angereicherte Kultur der primären Motoneurone (MNs) aus murinen Rückenmark vorzubereiten. Um die Folgen von Mutationen MN Krankheiten verursachen zu bewerten, beschreiben wir hier die Isolation dieser isolierten MNs und ihre Transfektion von Magnetofection.

Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Neurobiologie zu beantworten, wie motorische Neuronenpolarität, Axon-Führung, Axonhandel, und neurodegenerative Mechanismen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist es, eine hoch angereicherte motorische Neuronenkultur zu erhalten, während wir unser Knockdown-Protein nach minutenhoher Zuneigung ausdrücken. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie einen Embryo in eine Schale von Seziermedien mit Silizium kodiert.Halten Sie den Embryo unter dem Mikroskop mit der Zange mit dem Bauch gegen das Silizium. Mit dem zweiten Zangenpaar eine der Spitzen in den zentralen Kanal des Rostradrückenmarks einlegen. Schließen Sie dann die Zange, um das Rückengewebe leicht zu reißen.Wiederholen Sie diese Operation in Richtung der Seite, bis das gesamte Rückenmark geöffnet ist. Als nächstes positionieren Sie den Embryo so, dass das offene Rückenmark gegen das Silizium ist. Anschließend lösen Sie den rostradien Teil des Rückenmarks vom Körper.Kneifen Sie den Rostradteil des Rückenmarks und ziehen Sie den Embryo am Kopf, um das Rückenmark zu extrahieren. Ziehen Sie alle verbleibenden Hirngebungen und DRGs, die noch am Rückenmark befestigt sind, vorsichtig weg. Flachen Sie das Rückenmark auf dem Silizium und mit einem Skalpell, entfernen Sie die dorsale Hälfte der Schnur durch Schneiden entlang der Mitte jeder Seite.Schneiden Sie den mittleren Teil in zehn Stücke, und übertragen Sie sie in ein neues Rohr. Um die Zellsuspension der Rückenmarkszellen vorzubereiten, sammeln Sie die Rückenmarksstücke an der Unterseite des Rohres. HBSS durch einen Milliliter Schinken F-10 Medium ersetzen und zehn Mikroliter Trypsin hinzufügen.Inkubieren Sie die Röhre für zehn Minuten bei 37 Grad Celsius. Um die enzymatische Verdauung zu stoppen, übertragen Sie die Fragmente in ein neues 15-Milliliter-Rohr, das 800 Mikroliter komplettes L-15-Medium, 100 Mikroliter 4%BSA und 100 Mikroliter DNAs und Titrat enthält. Lassen Sie die Fragmente für zwei Minuten absetzen, bevor Sie den Überstand in einem frischen 15-Milliliter-Rohr sammeln.Fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter 4%BSA an der Unterseite des Überstandsrohrs hinzu. Centro verschmelzen es bei 470 x Schwerkraft für 5 Minuten. Nach 5 Minuten den Überstand entfernen und die Zellpalette mit 2 Millilitern komplettem L-15-Medium wieder aufhängen.Zur Motoneuronanreicherung die Zellsuspension in zwei 15-Milliliter-Röhren aufteilen. Fügen Sie dann zwei Milliliter L-15 PH Medium zu jeder Röhre hinzu. Wenn sie mit sechs Embryonen beginnen, verwenden Sie das Äquivalent von drei Embryonen pro Tube und drei Milliliter Medium.Fügen Sie langsam 2 Milliliter Dichtegradienzlösung an der Unterseite jedes Rohres hinzu, um eine scharfe Schnittstelle zu erhalten. Als nächstes zentrzentrieren Sie es bei 830 x Schwerkraft für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach diesem Schritt sollten sich kleine Zellen am unteren Rand des Rohres befinden, während große Zellen - wie das Motoneuron - an der Dichtegradientenlösung/medium Schnittstelle sein sollten.Asperae 1 bis 2 Milliliter der Zellen an der Schnittstelle und übertragen Sie sie in eine frische 15 Milliliter Tube. Stellen Sie die Lautstärke auf zehn Milliliter mit L-15 PH Medium ein. Anschließend zwei Milliliter des 4%BSA-Kissens an den Boden der beiden Röhren geben.Und zentrzentrieren Sie bei 470 x Schwerkraft für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 5 Minuten den Überstand entfernen und die Palette wieder aufhängen und 3 Milliliter komplettes L-15-Medium aufhängen. Wiederholen Sie das Zentrifugat bei 470 x Schwerkraft für 5 Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie dann den Überstand und hängen Sie die Zellpalette und zwei Milliliter des gesamten Kulturmediums wieder auf. Um motorische Neuronen zu kultiieren, verdünnen Sie sie auf 5 000-10 000 Zellen in 500 Mikroliter Kulturmedium pro Brunnen in einer 24-Well-Platte. Entfernen Sie dann die Laminae-Lösung mit der P-1 000 Pipettenspitze.Übertragen Sie die motorischen Neuronen sofort verdünnt in Kulturmedium. zu den Kodierungsplatten, um ein Trocknen zu vermeiden. Um DNA vorzubereiten, setzen Sie 1 Mikrogramm DNA in 50 Mikroliter neuropatorischen Kulturmedium wieder aus.Und Wirbel für 5 Sekunden. Um die B-Röhre vorzubereiten, setzen Sie 1,5 Mikroliter Perlen in 50 Mikroliter nneuronalen Kulturmedium wieder auf. 50 Mikroliter Perlenlösung zu 50 Mikroliter DNA-Lösung hinzufügen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Ziehen Sie während dieser Inkubation 100 Mikroliter Kulturmedium aus dem Brunnen ab, der transfiziert wird. Anschließend 100 Mikroliter der DNA-Perle auf jeden Brunnen übertragen. Und inkubieren Sie die 24 Brunnenplatte, 20-30 Minuten auf der Magnetplatte bei 37 Grad Celsius.Hier ist die modem-neuronmorphologische Ologie, die durch das Stehen der endogenen nicht-phosphorylierten Neurofilament schwere Kette nach vier Tagen Kultur offenbart. In diesen Bildern zeigen Sie die modem-neuronmorphologische Ologie nach vier Tagen in vitro und transfiziert für EGFP Transgen durch Magnetofektion am zweiten Tag. Motto-Neuronen wurden mit dem Marker SMI-32 oder dem Pan-Neuro-Marker TUJ-1 gegengefärbt und die Pfeile zeigen das Soma der Neuronen an.Dies sind ihre konfokalen Bilder von magneto-ektierten motorischen Neuronen, die wilde Typ- oder mutierte EGFP NEFH-Konstrukte ausdrücken und für ihren autophagischen Marker LC-3B gebeizt werden. Pfeile zeigen die mutierten EGFP NEFH Proteinaggregate, die auch LC-3B positiv sind Nach diesem Verfahren kann Montoholda curcha per Videomikroskopie analysiert werden, um den Axonhandel zu visualisieren und einige Hinweise hinzuzufügen. Nach seiner ersten Entwicklung, um grundlegende Fragen in der neuronalen Biologie anzugehen, erwies sich diese Technik auch als ein leistungsfähiges Werkzeug, um physiopathologische Mechanismen zu erforschen, die das Spektrum von Motoneuron-Störungen, wie toxische Schocksyndrom-Krankheit, Samuel trophische Lateralsklerose oder spinale Muskelatrophie, implizieren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Modellierung von Schlaganfällen bei Mäusen: Fokale kortikale Läsionen durch Photothrombose

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...