Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

ברצוננו להודות את "האגודה יציקת le développement de la neurogénétique" אחוות של ד ר Jacquier, AFM-הטלויזיונית על התמיכה באמצעות תוכנית אסטרטגית MyoNeurAlp. אנחנו רוצים גם תודה ד ר כריס הנדרסון, ד ר ויליאם camu ב, ד ר בריג'יט Pettmann, ד ר סדריק ראול ו ד ר גיאורג Haase, אשר השתתף בפיתוח ושיפור הטכניקה ולהפיץ את הידע שלהם.

בכל ההליכים הכרוכים חיות התקבלו על-ידי הוועדה האתית של המוסד.
1. פתרון הכנה
<ol><li>הכינו 10 מ"ל של 4% BSA דיאליזה L-15 בינוני.<ol>
<li>לפזר אבקת אלבומין שור ב- 4% (w/v) ב- 10 מ"ל של L-15 בינונית.</li>
		<li>הוסף את הפתרון קלטת דיאליזה 20 מ עם ניתוק kDa 20. Dialyze נגד 500 מ"ל של מדיום L-15 במשך 3 ימים תחת עצבנות ב 4 º C...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

אחד של נקודות קריטיות של פרוטוקול זה הוא העוברים העכבר הם שפרופסור-חלון זמן מדויק במהלך הפיתוח (E12.5) כדי למטב את כמות MNs שהושג בסופו של דבר. בנוסף, עבור תשואה אופטימלית, הקרע צריכה להתבצע בבוקר או בשעות אחר הצהריים המוקדמות. לפני E12.5 (למשל, ב- E11.5), ניתוח קשה, במיוחד לגבי חיסול של קרומי המוח....

מחלות נוירומוסקולריות מקיפים מגוון רחב של פתולוגיות ברורים קליניות, גנטית המאופיינת על ידי משינוי של שריר ו/או מערכת העצבים. הודות להתפתחות הטכנולוגית של טכנולוגיות רצף, מאות גנים אחראים אלה מחלות נדירות זוהו במהלך העשור האחרון (הרשימה זמינה במרכז המחלה Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). מגוון מוטציות מזוהה מציין כי מוטציות שונות בגן גן יחיד יכול לגרום מתבטא בצורות שונות ומחלות1,2,3 , כי מוטציות בגנים שונים ניתן לייצר דומה פנוטיפים 4 , 5. בהקשר זה, ישנם מאמצים לפתח דגמי הסלולר שיכולים להיות כלים רבי-עוצמה לניתוח ההשלכות מוטציה ומנגנונים פתולוגי.
MNs בעמוד השדרה יש somas גדולה הממוקמת הקרניים הבטני של חוט השדרה, אקסונים ארוכים טופס היעד סיבי שריר השלד, ולאפשר תנועות מרצון באמצעות השחרור אצטילכולין ובצמתים עצב-שריר. מאז MNs מושפעות על ידי מחלות נוירומוסקולריות כגון נוירודגנרטיביות, שארקו-מארי-טות (CMT), ניוון שרירי עמוד השדרה, דוקטור הנדרסון ועמיתיו פיתחו הראשון פרוטוקול6 שמותר קומפלקסים במבחנה MNs בעמוד השדרה, על גילוי neurotrophic גורם GDNF7 (תא גליה נגזר neurotrophic פקטור). ליטושים טכני מאז אפשרו לטיהור מדויקת יותר של עמוד השדרה MNs ובסוגי שלהם באמצעות FACS8, אך העשרה על ידי צפיפות הצבע נשאר בשימוש נרחב ועוצמתי במעבדות כרגע עובד עם MNs בעמוד השדרה הראשית 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. לאחר מכן, זה גם אפשרי להשיג ציון גבוה יותר של טיהור MN דרך immunopanning על ידי ניצול של סמן משטח p75(NTR)15,16,17.
חוט השדרה מכיל תתי סוגים שונים של צוואר הרחם,, מותניים MNs, וכן החציוני לרוחב המנוע וטורים שונים בין המיקום שלהם ב הצופר הקדמי על ציר dorso-הגחוני /, בין היעדים הם innervate8, 18. תרבויות MN הראשי יכול לשחזר את כל תת אלה MN בפרופורציות פיזיולוגיים. המגבלה העיקרית של שיטה זו הוא המספר הנמוך של MNs שהושג בסופו של ההליך; למעשה, ניתן לצפות להשיג סביב 105 MNs של שישה עוברי, אשר מתאימה מיקרוסקופ, אבל הגבלת לניסויים ביוכימיה. ביצוע ניסויים עם יותר סטנדרטית יחוברו, שופע MNs (> 106 תאים) עובריים תאי גזע-derived MNs צריך להיחשב18.
תרביות תאים של transgenes פראי-סוג/מוטציה או תמונות ציפורים גנים אנדוגני לתוך MNs העיקרי הוא כלי מהיר ויעיל עבור פענוח מסלולים physiopathological, במיוחד כאשר העכבר מודלים אינן זמינות. Magnetofection היא טכניקה אחת עבור נוירונים העיקרי transfecting, הדומה lipofection בלי neurotoxicity קשורים. יתר על כן, ניתן לבצע תרביות תאים בנוירונים בוגרים לאחר מספר ימים במבחנה, בניגוד טכניקות בהתבסס על אלקטרופורציה9. אולם חיסרון אחד של שיטה זו הוא כי החרוזים לאגד חומצות גרעין בתרבות, גרימת רעש דאפי תיוג. זיהום ויראלי הוא כנראה הטכניקה היעילה ביותר עבור transfecting MNs; עם זאת, magnetofection אינו מצריך מסוימים נהלי הבטיחות לצורך ייצור ויראלי ולדלקת הסלולר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

הייתה שם הקשורים ניוון מוחיים של עמוד השדרה motoneurons (MNs) במגוון גדול של הפרעות נוירולוגיות כולל נוירודגנרטיביות שארקו-מארי-טות ', ניוון שרירי עמוד השדרה, אשר ישויכו כולן ניוון שרירים. תרבויות העיקרי MNs בעמוד השדרה היו בשימוש נרחב כדי להדגים את מעורבותם של גנים ספציפיים במחלות כגון ולאפיין את ההשלכות שלהם מוטציות הסלולר. תרבות זו מודלים MN העיקרי פרוטוקול נגזר העבודה החלוצי של הנדרסון ועמיתיו לפני יותר מעשרים שנה. ראשית, אנחנו פירוט שיטת לנתח את הקרניים הקדמי של חוט השדרה של העובר העכבר ובידוד MNs מגבולות תאים באמצעות מעבר הדרגתי צפיפות. לאחר מכן, אנו מציגים דרך חדשה ביעילות transfecting MNs עם פלסמידים ביטוי באמצעות magnetofection. בסופו של דבר, אנחנו להמחיש כיצד לתקן, immunostain העיקרי ש-mns. באמצעות neurofilament מוטציות הגורמות שארקו-מארי-שן מחלות מסוג 2, פרוטוקול זה מדגים בגישה איכותית המבטאים חלבונים עניין ולימוד שלהם מעורבות MN, תחזוקה, וצמיחה של הישרדות.

לאחר 24 שעות בתרבות, motoneurons (MNs) כבר להראות צמיחה משמעותית עצב (לפחות 6 פעמים יותר מאשר הגודל soma). בימים שלאחר מכן, אקסונים צריך להמשיך לצמוח ולהציג מסעף (איור 2). יהיו מורפולוגיות שונות עקב סוג של specificities. לדוגמה, העמודה החציוני MNs זה innervate השרירים צירית יש אקסונ?...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

מטרת טכניקה זו היא להכין תרבות מועשר של ראשי motoneurons (MNs) של חוט השדרה מאתר. כדי להעריך את ההשלכות של מוטציות גורמות למחלות MN, נתאר כאן ניתוקה של אלה מבודדים MNs של תרביות תאים שלהם על-ידי magnetofection.

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

שיטה זו יכולה לעזור לטפל בשאלות מפתח בנוירוביולוגיה, כגון קוטביות נוירונים מוטוריים, הדרכת אקסון, סחר באקסון ומנגנונים נוירודגנרטיביים. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא להשיג תרבות נוירון מוטורי מועשר מאוד בזמן שאנחנו לוקחים לבטא את החלבון שלנו על ידי חיבה דקה. כדי להתחיל בהליך זה, מניחים עובר אחד בצלחת של מדיה ניתוח מקודד עם סיליקון.מתחת למיקרוסקופ, להחזיק את העובר עם הבטן נגד הסיליקון עם מדפים. עם זוג המדפים השני, הכנס את אחד הטיפים לתעלה המרכזית של חוט השדרה rostrad. לאחר מכן, סגור את המדפים כדי לקרוע מעט את רקמת הגב.חזור על פעולה זו לכיוון הצד של קונל עד שכל חוט השדרה ייפתח. לאחר מכן, מקם את העובר כך חוט השדרה הפתוח הוא נגד הסיליקון. לאחר מכן, לנתק את החלק rostrad של חוט השדרה מהגוף.צבוט את החלק rostrad של חוט השדרה, ולמשוך את העובר על ידי הראש כדי לחלץ את חוט השדרה. בזהירות למשוך את כל קרום המוח הנותר DRGs עדיין מחובר לחוט השדרה. משטחים את חוט השדרה על הסיליקון ולהשתמש באזמל, מסירים את החצי הגבי של החוט על ידי חיתוך לאורך אמצע כל צד.חותכים את החלק האמצעי לעשר חתיכות, ומעבירים אותם לצינור חדש. כדי להכין את ההשעיה התאית של חוט השדרה, לאסוף את חתיכות חוט השדרה בתחתית הצינור. החלף HBSS עם מיליליטר אחד של Ham F-10 בינוני ולהוסיף עשרה microliters של טריפסין.דגירה הצינור במשך עשר דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את העיכול האנזימטי, העבר את השברים לצינור חדש בגודל 15 מיליליטר, המכיל 800 מיקרוליטרים של מדיום L-15 שלם, 100 מיקרוליטרים של 4%BSA ו-100 מיקרוליטרים של DNAs ו- titrate, פעמיים. תן לרסיסים להתיישב במשך שתי דקות לפני איסוף העל-טבעי בצינור טרי של 15 מיליליטר.הוסיפו בעדינות שני מיליליטר של 4%BSA בתחתית הצינור העל-טבעי. סנטרו להתיך אותו ב 470 x כבידה במשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, להסיר את supernatant מחדש להשעות את משטח התא עם 2 מיליליטר של מלא L-15 בינוני.להעשרת מוטונורון, לפצל את ההשעיה התא לשני צינורות 15 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של L-15 PH בינוני לכל צינור. אם מתחיל עם שישה עוברים, להשתמש המקבילה של שלושה עוברים לכל צינור, ושלושה מיליליטר של בינוני.לאט להוסיף 2 מיליליטר של פתרון gradience צפיפות, לתחתית של כל צינור כדי לקבל ממשק חד. לאחר מכן, סנטרו להתיך אותו ב 830 x כבידה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלב זה, תאים קטנים צריכים להיות בתחתית הצינור, ואילו תאים גדולים - כגון motoneuron-צריך להיות בפתרון שיפוע צפיפות / ממשק בינוני.אספרה 1 עד 2 מיליליטר של התאים בממשק ולהעביר אותם לצינור טרי 15 מיליליטר. כוונן את עוצמת הקול לעשרה מיליליטר עם מדיום L-15 PH. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של כרית 4%BSA לתחתית של שני צינורות.ופתיל סנטרו ב 470 x כבידה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 5 דקות, להסיר את supernatant מחדש להשעות את המשטח ו 3 מיליליטר של מלא L-15 בינוני. חזור על centrifugate ב 470 x כוח הכבידה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להסיר את supernatant מחדש להשעות את משטח התא ושני מיליליטר של מדיום תרבות מלאה. כדי לתרבת נוירונים מוטוריים, לדלל אותם ל 5, 000-10, 000 תאים ב 500 microliters של תרבות בינוני לגם בצלחת 24 גם. לאחר מכן, להסיר את פתרון laminae עם ב P-1, 000 טיפ צינור.מיד להעביר את הנוירונים המוטוריים מדוללים בינוני תרבות. לצלחות הקידוד כדי למנוע ייבוש. כדי להכין DNA, להשעות מחדש 1 מיקרוגרם של DNA ב 50 microliters של מדיום תרבות עצבית.ומערבולת למשך 5 שניות. כדי להכין את צינור B, להשעות מחדש 1.5 microliters של חרוזים ב 50 microliters של מדיום תרבות עצבית. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תותר חרוזים ל-50 מיקרוליטרים של תות פתרון דנ"א ודגירה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.במהלך הדגירה הזו, משיכת 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבות מהברית שתנותב. לאחר מכן, להעביר 100 microliters של תערובת חרוזים DNA לכל באר. ודהר את צלחת 24 באר, 20-30 דקות על הלוח המגנטי ב 37 מעלות צלזיוס.מוצג כאן, הוא מורפולוגיה נוירון מודם מתגלה על ידי עמידה של שרשרת נוירופילמנט אנדוגני שאינו זרחן כבד לאחר ארבעה ימים של תרבות. בתמונות אלה, הצג את מורפולוגיה נוירון מודם לאחר ארבעה ימים במבחנה ו transfected עבור גן טרנס EGFP על ידי magnetofection ביום השני. נוירונים מוטו היו מוכתמים נגד עם הסמן SMI-32 או סמן פאן-נוירו TUJ-1 ואת החצים מצביעים על סומה של הנוירונים.אלה הם תמונות confocal שלהם של נוירונים מוטוריים מגנטו fected, המביעים סוג פראי או מוטציה EGFP NEFH מבנים מוכתמים עבור סמן autophagic שלהם LC-3B. חצים מראים את מוטציה EGFP NEFH אגרגטים חלבון כי הם גם LC-3B חיובי בעקבות הליך זה, montoholda curcha ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופיה וידאו לדמיין סחר אקסון ולהוסיף קצת הדרכה. לאחר ההתפתחות הראשונית שלה כדי לענות על שאלות בסיסיות בביולוגיה עצבית, טכניקה זו גם להוכיח להיות כלי רב עוצמה לחקור מנגנונים פיזיולוגיים המסבכים את הספקטרום של הפרעות motoneuron, כגון מחלת תסמונת הלם רעיל, טרשת נפוצה כללית סמואל טרופי, או ניוון שרירים בעמוד השדרה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

איתור של הפלאק מדלקת עצבים במודל מחלת אלצהיימר עכבר

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

במבחנת דוגמנות של פלישה העצבית סרטנית: מודל גנגליון השורש הגבה

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

שבץ דוגמנות בעכברים: נגעים קליפת המוח מוקד על ידי פוטוטרומבוזיס

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...