Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

हम Telethon रणनीतिक योजना के माध्यम से अपने समर्थन के लिए डॉ Jacquier फैलोशिप और AFM-MyoNeurAlp के लिए "एसोसिएशन डालो le développement de la neurogénétique" शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम यह भी डॉ. क्रिस हेंडरसन, डॉ विलियम Camu, डॉ ब्रिजित Pettmann, डॉ सिडरिक Raoul, और डॉ Georg हास, जो विकसित करने और तकनीक में सुधार लाने और उनके ज्ञान को फैलाने में भाग लिया शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

पशुओं को शामिल करने वाली सभी प्रक्रियाओं को संस्था की नैतिक समिति ने स्वीकार कर लिया ।
1. समाधान तैयारी
<ol><li>एल-15 मीडियम में 4% BSA dialyzed के 10 मिलीलीटर तैयार करें ।<ol>
<li>एल-15 मध्यम के 10 मिलीलीटर में 4% (डब्ल?...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक यह है कि माउस भ्रूण विकास के दौरान एक सटीक समय खिड़की पर विच्छेदित कर रहे है (12.5 ई) के लिए अंत में प्राप्त MNs की राशि का अनुकूलन । इसके अलावा, इष्टतम उपज के लिए, व...

Neuromuscular रोग चिकित्सीय और आनुवंशिक रूप से अलग विकृतियों कि मांसपेशियों और/या तंत्रिका तंत्र के परिवर्तन की विशेषता है की एक किस्म शामिल हैं । अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में अग्रिमों के कारण, इन दुर्लभ विकारों के लिए जिंमेदार जीन के सैकड़ों पिछले दशक के दौरान की पहचान की गई है (Neuromuscular रोग केंद्र, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html पर उपलब्ध सूची) । की पहचान की उत्परिवर्तनों की विविधता इंगित करता है कि एक जीन में विभिंन उत्परिवर्तनों अलग phenotypes और1,2,3 रोगों का कारण हो सकता है और विभिंन जीनों में उत्परिवर्तनों समान phenotypes का उत्पादन कर सकते है 4 , 5. इस संदर्भ में, वहां सेलुलर मॉडल है कि उत्परिवर्तन परिणाम और रोग तंत्र का विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली उपकरण बन सकता है विकसित करने के लिए प्रयास कर रहे हैं ।
स्पाइनल अजेंडे बड़ी सोमाs रीढ़ की हड्डी के ventral सींग में स्थित है, कंकाल की मांसपेशी फाइबर लक्ष्य के लिए फार्म लंबा axons, और neuromuscular जंक्शनों पर acetylcholine की रिहाई के माध्यम से स्वैच्छिक आंदोलनों के लिए अनुमति देते हैं । MNs के बाद से पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, Charcot-Marie-टूथ रोग (CMT), और रीढ़ की मांसपेशियों शोष, Dr. हेंडरसन और सहयोगियों की खेती के लिए अनुमति दी है कि पहली प्रोटोकॉल 6 विकसित के रूप में neuromuscular रोगों से प्रभावित कर रहे है इन विट्रो में स्पाइनल एमएनएस और neurotrophic फैक्टर GDNF7 (glial सेल व्युत्पन्न neurotrophic फैक्टर) की खोज में जुटे हैं । तकनीकी शोधन तब से रीढ़ की हड्डी के अधिक सटीक शुद्धिकरण के लिए अनुमति दी है मनसे और उनके FACS8का उपयोग कर प्रकार, लेकिन घनत्व ढाल द्वारा संवर्धन शक्तिशाली रहता है और व्यापक रूप से वर्तमान में प्राथमिक रीढ़ की हड्डी के साथ काम कर रहे प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. तत्पश्चात्, यह भी संभव है कि सतह मार्कर p75(NTR)15,16,17के लाभ लेने के द्वारा immunopanning के माध्यम से एक उच्च एमएन शुद्धि ग्रेड प्राप्त करने के लिए ।
रीढ़ की हड्डी ग्रीवा, वक्ष, और काठ का MNs के विभिन्न उपप्रकार शामिल हैं, साथ ही माध्य और पार्श्व मोटर कॉलम है कि एक dorso-ventral धुरी पर पूर्वकाल सींग में उनके स्थान के बीच में अलग और लक्ष्य वे 8 अंदर आनाके बीच, 18. प्राथमिक mn संस्कृतियों शारीरिक अनुपात में इन mn उपप्रकार के सभी ठीक हो सकता है । इस तकनीक की मुख्य सीमा प्रक्रिया के अंत में प्राप्त अजेंडे की कम संख्या है; वास्तव में, यह छह भ्रूण, जो माइक्रोस्कोपी लेकिन जैव रसायन प्रयोगों के लिए सीमित के लिए उपयुक्त है से 105 मनसे के आसपास प्राप्त करने की उंमीद कर सकते हैं । अधिक मानकीकृत उपप्रकारों और प्रचुर मात्रा में mns (> 106 कोशिकाओं) के साथ प्रयोग करने के लिए, भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पंन मनसे18माना जाना चाहिए ।
अभिकर्मक के जंगली-प्रकार/उत्परिवर्ती transgenes या पछाड़ना अंतर्जात जीन प्राथमिक MNs में physiopathological रास्ते, विशेष रूप से जब माउस मॉडल अनुपलब्ध है समझने के लिए एक तेजी से और उपयोगी उपकरण है । Magnetofection transfecting प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए एक तकनीक है, संबंधित neurotoxicity के बिना lipofection के समान. इसके अलावा, अभिकर्मक में कई दिनों के बाद परिपक्व ंयूरॉंस पर किया जा सकता है विट्रो,9electroporation के आधार पर तकनीक के विपरीत । हालांकि, इस तकनीक का एक नुकसान यह है कि मोतियों की संस्कृति में न्यूक्लिक एसिड बांध, DAPI लेबलिंग में शोर पैदा कर रहा है । वायरल संक्रमण की संभावना transfecting MNs के लिए सबसे कुशल तकनीक है; हालांकि, magnetofection कुछ सुरक्षा वायरल उत्पादन और सेलुलर संक्रमण के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Neurodegeneration स्पाइनल motoneurons (मनसे) पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, Charcot-Marie-दांत रोग, और रीढ़ की मांसपेशियों शोष, जो सभी मांसपेशियों शोष के साथ जुड़े रहे हैं सहित स्नायविक विकारों के एक बड़े स्पेक्ट्रम में फंसा है । रीढ़ की हड्डी MNs की प्राथमिक संस्कृतियों व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है ऐसे रोगों में विशिष्ट जीन की भागीदारी का प्रदर्शन और उनके उत्परिवर्तनों के सेलुलर परिणामों की विशेषता । इस प्रोटोकॉल मॉडल एक प्राथमिक MN हेंडरसन और सहयोगियों से अधिक बीस साल पहले के लाभदायक काम से व्युत्पंन संस्कृति । सबसे पहले, हम विस्तार एक माउस भ्रूण से रीढ़ की हड्डी के पूर्वकाल सींग विदारक और पड़ोसी कोशिकाओं से MNs अलग एक घनत्व ढाल का उपयोग करने का एक तरीका है । उसके बाद, हम magnetofection का उपयोग plasmids अभिव्यक्ति के साथ कुशलता से transfecting MNs का एक नया तरीका प्रस्तुत करते हैं । अंत में, हम वर्णन कैसे ठीक करने के लिए और immunostain प्राथमिक MNs । neurofilament उत्परिवर्तनों कि कारण Charcot-Marie-टूथ रोग प्रकार 2 का उपयोग कर, इस प्रोटोकॉल ब्याज की प्रोटीन व्यक्त करने और उनकी भागीदारी का अध्ययन करने के लिए एक गुणात्मक दृष्टिकोण दर्शाता है MN विकास, रखरखाव, और अस्तित्व ।

संस्कृति में 24 घंटे के बाद motoneurons (मनसे) को पहले से ही महत्वपूर्ण axonal वृद्धि (सोमा आकार से कम 6 गुना अधिक) दिखाना चाहिए । अगले दिनों में, axons बढ़ने और शाखाओं का प्रदर्शन (चित्रा 2) जारी रखना...

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Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

इस तकनीक का लक्ष्य murine रीढ़ की हड्डी से प्राथमिक motoneurons (मनसे) की एक अत्यधिक समृद्ध संस्कृति तैयार करना है. MN रोगों के कारण उत्परिवर्तनों के परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए, हम यहां magnetofection द्वारा इन अलग MNs और उनके अभिकर्मक के अलगाव का वर्णन ।

Transfecting माउस प्राथमिक Motoneurons द्वारा इन विट्रो में Charcot-Marie-टूथ रोग मॉडलिंग

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

इस विधि से न्यूरोबायोलॉजी में महत्वपूर्ण प्रश्नों का समाधान करने में मदद मिल सकती है, जैसे मोटर न्यूरॉन पोलरिटी, एक्सॉन गाइडेंस, एक्सॉन ट्रैफिकिंग और न्यूरोडीजेनेरेटिव मैकेनिज्म। इस तकनीक का मुख्य लाभ एक अत्यधिक समृद्ध मोटर न्यूरॉन संस्कृति प्राप्त करना है, जबकि हम मिनट स्नेह द्वारा अपने नॉकडाउन प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए लेते हैं। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, सिलिकॉन के साथ कोडित विच्छेदन मीडिया के एक पकवान में एक भ्रूण रखें।माइक्रोस्कोप के नीचे, संदंश के साथ सिलिकॉन के खिलाफ पेट के साथ भ्रूण पकड़ो। संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ, रोस्ट्रड रीढ़ की हड्डी के केंद्रीय नहर में सुझावों में से एक डालें। फिर, पृष्ठीय ऊतक को थोड़ा फाड़ने के लिए संदंश बंद करें।इस ऑपरेशन को कॉनेल साइड की ओर तब तक दोहराएं जब तक कि पूरी रीढ़ की हड्डी खुल न जाए। इसके बाद, भ्रूण को स्थिति में रखें ताकि खुली रीढ़ की हड्डी सिलिकॉन के खिलाफ हो। इसके बाद, रीढ़ की हड्डी के रोस्ट्रेड हिस्से को शरीर से अलग करें।रीढ़ की हड्डी के रोस्ट्रेड हिस्से को पिंच करें, और रीढ़ की हड्डी निकालने के लिए भ्रूण को सिर से खींचें। ध्यान से दूर किसी भी शेष meninges और DRGs अभी भी रीढ़ की हड्डी से जुड़ी खींच । सिलिकॉन पर रीढ़ की हड्डी को समतल करें और एक स्केलपेल का उपयोग करके, प्रत्येक पक्ष के बीच में काटकर कॉर्ड के पृष्ठीय आधे हिस्से को हटा दें।बीच के हिस्से को दस टुकड़ों में काट लें, और उन्हें एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। रीढ़ की हड्डी सेल निलंबन तैयार करने के लिए, ट्यूब के नीचे रीढ़ की हड्डी के टुकड़े इकट्ठा करें। एचबीएसएस को हैम एफ-10 माध्यम के एक मिलीलीटर से बदलें और ट्राइपसिन के दस माइक्रोलीटर जोड़ें।ट्यूब को दस मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एंजाइमेटिक पाचन को रोकने के लिए, टुकड़ों को एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिसमें पूर्ण एल-15 माध्यम के 800 माइक्रोलीटर, 4% बीएसए के 100 माइक्रोलीटर, और डीएनए और टिट्रेट के 100 माइक्रोलीटर दो बार शामिल हैं। टुकड़े एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब में सुपरनैटर इकट्ठा करने से पहले दो मिनट के लिए व्यवस्थित करते हैं ।धीरे-धीरे सुपरनैट ट्यूब के नीचे 4% बीएसए के दो मिलीलीटर जोड़ें। सेंट्रो इसे 5 मिनट के लिए 470 x गुरुत्वाकर्षण पर फ्यूज करता है। 5 मिनट के बाद, सुपरनेट निकालें और सेल पैलेट को 2 मिलीलीटर पूर्ण एल-15 माध्यम के साथ फिर से निलंबित करें।मोटोन्यूरॉन संवर्धन के लिए, सेल निलंबन को दो 15 मिलीलीटर ट्यूबों में विभाजित करें। इसके बाद हर ट्यूब में एल-15 पीएच मीडियम के दो मिलीलीटर डालें। यदि छह भ्रूण के साथ शुरू, ट्यूब प्रति तीन भ्रूण के बराबर का उपयोग करें, और माध्यम के तीन मिलीलीटर ।धीरे-धीरे एक तेज इंटरफ़ेस प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ट्यूब के नीचे 2 मिलीलीटर घनत्व ग्रेडेंस समाधान जोड़ें। इसके बाद, सेंट्रो इसे कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 830 x गुरुत्वाकर्षण पर फ्यूज करता है। इस कदम के बाद छोटी कोशिकाएं ट्यूब के नीचे होनी चाहिए, जबकि बड़ी कोशिकाएं-जैसे मोटोन्यूरॉन-घनत्व ढाल समाधान/मध्यम इंटरफेस पर होनी चाहिए ।इंटरफ़ेस पर कोशिकाओं के एस्पेरा 1 से 2 मिलीलीटर और उन्हें एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। वॉल्यूम को एल-15 पीएच मीडियम के साथ दस मिलीलीटर में एडजस्ट करें। इसके बाद, दो ट्यूबों के नीचे 4% बीएसए कुशन के दो मिलीलीटर जोड़ें।और सेंट्रो कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 470 x गुरुत्वाकर्षण पर फ्यूज। 5 मिनट के बाद सुपरनेट निकालें और पैलेट और 3 मिलीलीटर कंप्लीट एल-15 मीडियम को फिर से सस्पेंड कर दें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 470 x गुरुत्वाकर्षण पर अपकेंद्रित्र दोहराएं।फिर, सुपरनेट को हटा दें और सेल पैलेट और पूर्ण संस्कृति माध्यम के दो मिलीलीटर को फिर से निलंबित करें। मोटर न्यूरॉन्स संस्कृति के लिए, उन्हें एक 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के 500 माइक्रोलीटर में 5, 000-10, 000 कोशिकाओं को पतला करें। फिर, पी-1, 000 पिपेट टिप पर लैमिने समाधान को हटा दें।तुरंत संस्कृति माध्यम में पतला मोटर न्यूरॉन्स स्थानांतरित करें। सुखाने से बचने के लिए कोडिंग प्लेटों के लिए। डीएनए तैयार करने के लिए न्यूरोनल कल्चर मीडियम के 50 माइक्रोलीटर में 1 माइक्रोग्राम डीएनए को फिर से सस्पेंड करें।और 5 सेकंड के लिए भंवर। बी ट्यूब तैयार करने के लिए, न्यूरोनल कल्चर मीडियम के 50 माइक्रोलीटर में मोतियों के 1.5 माइक्रोलीटर को फिर से निलंबित करें। डीएनए समाधान के 50 माइक्रोलीटर के लिए मनका समाधान के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।इस इनक्यूबेशन के दौरान, वेल से संस्कृति माध्यम के 100 माइक्रोलीटर वापस लें जो संक्रमित होंगे। इसके बाद, डीएनए मनका मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर को प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें। और 24 अच्छी तरह से थाली, चुंबकीय प्लेट पर 20-30 मिनट ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।यहां दिखाया गया है, मॉडेम न्यूरॉन आकृति विज्ञान संस्कृति के चार दिनों के बाद अंतर्जात गैर-फॉस्फोरिलेटेड न्यूरोफिलामेंट भारी श्रृंखला के खड़े होने से पता चला है। इन छवियों में, विट्रो में चार दिनों के बाद मॉडेम न्यूरॉन आकृति विज्ञान दिखाएं और दो दिन में मैग्नेटोफेक्शन द्वारा ईजीएफपी ट्रांस जीन के लिए संक्रमित। आदर्श वाक्य न्यूरॉन्स मार्कर SMI-३२ या पैन न्यूरो मार्कर TUJ-1 के साथ जवाबी दाग थे और तीर न्यूरॉन्स के सोमा का संकेत मिलता है ।ये मैग्नेटो संक्रमित मोटर न्यूरॉन्स की उनकी कॉन्फोकल छवियां हैं, जो जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती ईजीएफपी NEFH निर्माण को व्यक्त करते हैं और उनके ऑटोफैजिक मार्कर एलसी-3बी के लिए दाग देते हैं। तीर उत्परिवर्ती ईजीएफपी NEFH प्रोटीन समुच्चय दिखाते हैं जो इस प्रक्रिया के बाद एलसी-3 बी सकारात्मक भी हैं, मोंटोहोल्डा कर्चा का विश्लेषण वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा एक्सॉन तस्करी की कल्पना करने और कुछ मार्गदर्शन जोड़ने के लिए किया जा सकता है। तंत्रिका जीव विज्ञान में बुनियादी सवालों को संबोधित करने के लिए अपने प्रारंभिक विकास के बाद, यह तकनीक विषाक्त शॉक सिंड्रोम रोग, सैमुअल ट्रॉफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस, या स्पाइनल मस्कुलर शोष जैसे मोटिवोन्यूरॉन विकारों के स्पेक्ट्रम को फंसाने वाले फिजियो पैथोलॉजिकल तंत्र का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण भी साबित होती है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

माउस रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के द्वारा अभिकर्मक Vivo में Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Neuritic सजीले टुकड़े अल्जाइमर रोग माउस मॉडल में जांच

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectin आधारित और माउस भ्रूणीय motoneurons के अलगाव संस्कृति

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

माउस प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में Microregional Hypoxia की अंतर्जात NADH प्रतिदीप्ति की दो photon इमेजिंग द्वारा जांच

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि आदर्श: कैंसर तंत्रिका आक्रमण की इन विट्रो मॉडलिंग में

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

माउस प्राथमिक अनुमस्तिष्क granules न्यूरॉन्स में ंयूरॉन मौत और अध कि मॉडलिंग

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

लक्षण वर्णन और घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा माउस प्राथमिक Microglia के अलगाव

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

माउस प्राथमिक Oligodendrocytes के तीव्र और विशिष्ट Immunomagnetic अलगाव

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

माउस भ्रूण स्टेम सेल इन विट्रो से न्यूरोनल भेदभाव

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

चूहों में मॉडलिंग स्ट्रोक: फोकल कॉर्टिकल घाव फोटोथ्रोम्बोसिस द्वारा

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...