Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Vorremmo ringraziare la "Association pour le développement de la neurogénétique" del Dr. Jacquier fellowship e AFM-Telethon per il suo sostegno attraverso il piano strategico MyoNeurAlp. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul e Dr. Georg Haase, che hanno partecipato a sviluppare e migliorare la tecnica e diffondere la loro conoscenza.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state accettate dal comitato etico dell'istituzione.
1. soluzione preparazione
<ol><li>Preparare 10 mL di 4% BSA dializzata nel mezzo di L-15.<ol>
<li>Sciogliere polvere di albumina di siero bovino al 4% (p/v) in 10 mL di terreno di L-15.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione a una cassetta di dialisi da 20 mL con un cut-off kDa 20. Dializzare contro 500 mL di terreno L-15 per 3 giorni sotto agitazione a 4 ° C. Cambiare il mezzo di L-15 ogni ...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

Uno dei punti critici di questo protocollo è che gli embrioni del mouse vengono sezionati in una finestra di tempo preciso durante lo sviluppo (12.5) per ottimizzare la quantità di MNs ottenuti alla fine. Inoltre, per una resa ottimale, la dissezione deve essere eseguita al mattino o nel primo pomeriggio. Prima 12.5 (ad es., a E11.5), la dissezione è difficile, soprattutto per quanto riguarda l'eliminazione delle meningi. Dopo 12.5, il numero di MNs ottenuti scende significativamente. Per controllare la fase ...

Malattie neuromuscolari comprendono una varietà di patologie clinicamente e geneticamente distinte che si caratterizzano per l'alterazione del muscolo e/o il sistema nervoso. A causa dei progressi nelle tecnologie di sequenziamento, centinaia di geni responsabili di questi disordini rari è stati identificati durante l'ultimo decennio (elenco disponibile presso il centro di malattie neuromuscolari, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La varietà di mutazioni identificate indica che mutazioni differenti in un singolo gene possono causare diversi fenotipi e malattie1,2,3 e che mutazioni in geni differenti possono produrre fenotipi simili 4 , 5. in questo contesto, ci sono gli sforzi per sviluppare modelli cellulari che possono diventare potenti strumenti per analizzare le conseguenze di mutazione e meccanismi patologici.
MNs spinale hanno grande somas situato nelle corna ventrale del midollo spinale, gli assoni lunghi forma come target fibre muscolari scheletriche e consentire movimenti volontari attraverso il rilascio di acetilcolina alle giunzioni neuromuscolari. Poiché MNs sono colpiti da malattie neuromuscolari come la sclerosi laterale amiotrofica, la malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) e l'atrofia muscolare spinale, Dr. Henderson e colleghi ha sviluppato il primo protocollo n.6 che ha permesso per la coltivazione di in vitro spinale MNs e la scoperta di neurotrophic factor GDNF7 (fattore neurotrophic derivato delle cellule gliali). Raffinatezze tecniche da allora hanno consentito una più accurata purificazione di MNs spinale e relativi sottotipi usando FACS8, ma arricchimento mediante gradiente di densità rimane potente e ampiamente utilizzati nei laboratori attualmente lavorando con MNs spinale primaria 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. successivamente, è anche possibile ottenere un grado di purificazione MN superiore attraverso immunopanning, approfittando di superficie dell'indicatore p75(NTR)15,16,17.
Il midollo spinale contiene diversi sottotipi di MNs cervicale, toracica e lombare, nonché colonne motore mediani e laterali che differiscono tra loro posizione nel corno anteriore su un asse dorso-ventrale e tra i bersagli innervate8, 18. culture MN primario possono recuperare tutti questi sottotipi di MN in proporzioni fisiologiche. Il limite principale di questa tecnica è il basso numero di MNs ottenuti al termine della procedura; in realtà, ci si attende di ottenere circa 105 MNs da sei embrioni, che è adatto per la microscopia ma limitante per esperimenti di biochimica. Per eseguire esperimenti con più standardizzati sottotipi e MNs abbondanti (> 106 cellule), embrionale MNs derivati da cellule staminali dovrebbe essere considerato18.
Transfezione di selvaggio-tipo/mutante transgeni o atterramento geni endogeni nelle primarie MNs è uno strumento rapido e utile per decifrare le vie fisiopatologiche, soprattutto quando non sono disponibili modelli murini. Magnetofection è una tecnica per trasfezione neuroni primari, simili a lipofezione senza la neurotossicità correlata. Inoltre, la transfezione può essere eseguita su neuroni maturi dopo diversi giorni in vitro, a differenza di tecniche basate su elettroporazione9. Tuttavia, uno svantaggio di questa tecnica è che le perle si legano gli acidi nucleici nella cultura, causando rumore in DAPI etichettatura. Infezione virale è probabilmente la tecnica più efficiente per trasfezione MNs; Tuttavia, magnetofection non richiede determinate procedure di sicurezza necessarie per la produzione virale e infezione cellulare.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Neurodegenerazione dei motoneuroni spinali (MNs) è implicata in un ampio spettro di disturbi neurologici, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth e atrofia muscolare spinale, che sono tutti associati ad atrofia muscolare. Colture primarie di MNs spinale sono stati utilizzati ampiamente per dimostrare il coinvolgimento di geni specifici in tali malattie e caratterizzare le conseguenze cellulari delle loro mutazioni. Questa cultura di modelli un MN primario del protocollo derivato dal lavoro seminale di Henderson e colleghi più di venti anni fa. In primo luogo, abbiamo un metodo di dissezione corni anteriori del midollo spinale da un embrione di topo e isolando il MNs da cellule utilizzando un gradiente di densità vicine in dettaglio. Quindi, vi presentiamo un nuovo modo di trasfezione in modo efficiente MNs con plasmidi di espressione utilizzando magnetofection. Infine, illustriamo come risolvere e immunostain primaria che MNS. utilizzando mutazioni di neurofilament che causano la malattia di Charcot-Marie-Tooth, tipo 2, questo protocollo dimostra un approccio qualitativo che esprimono le proteine di interesse e studiare il loro coinvolgimento nella Crescita di MN, la manutenzione e la sopravvivenza.

Dopo 24 ore nella cultura, motoneuroni (MNs) dovrebbero mostrare già significativa crescita assonale (almeno 6 volte supera rispetto alla dimensione di soma). Nei giorni seguenti, gli assoni dovrebbero continuare a crescere ed esposizione di ramificazione (Figura 2). Ci saranno diverse morfologie a causa della specificità del sottotipo. Ad esempio, colonna mediana MNs che innervano i muscoli assiali hanno assoni più brevi e più ramificati rispetto colonna...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

L'obiettivo di questa tecnica è quello di preparare una cultura altamente arricchita dei motoneuroni primari (MNs) da murino del midollo spinale. Per valutare le conseguenze delle mutazioni che causano malattie MN, descriviamo qui l'isolamento di questi isolati MNs e loro transfezione di magnetofection.

Malattia di Charcot-Marie-Tooth In Vitro di modellazione di trasfezione motoneuroni primari del Mouse

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Questo metodo può aiutare ad affrontare questioni chiave in neurobiologia, come la polarità dei motoneuroni, la guida dell'assone, il traffico di assone e i meccanismi neurodegenerativi. Il principale vantaggio di questa tecnica è quello di ottenere una cultura del motoneurone altamente arricchita mentre prendiamo per esprimere la nostra proteina knockdown per affetto minuto. Per iniziare questa procedura, mettere un embrione in un piatto di mezzi di dissezione codificati con silicio.Al microscopio, tenere l'embrione con l'addome contro il silicio con le forcep. Con la seconda coppia di forcep, inserire una delle punte nel canale centrale del midollo spinale rostrad. Quindi, chiudere le forcep per strappare leggermente il tessuto dorsale.Ripetere questa operazione verso il lato connell fino all'apertura dell'intero midollo spinale. Quindi, posizionare l'embrione in modo che il midollo spinale aperto sia contro il silicio. Successivamente, staccare la parte rostrad del midollo spinale dal corpo.Pizzicare la parte rostrad del midollo spinale e tirare l'embrione dalla testa per estrarre il midollo spinale. Allontanare con cura tutte le meningi e le DRAG rimanenti ancora attaccate al midollo spinale. Appiattire il midollo spinale sul silicio e usando un bisturi, rimuovere la metà dorsale del cordone tagliando lungo il centro di ciascun lato.Tagliare la parte centrale in dieci pezzi e trasferirli in un nuovo tubo. Per preparare la sospensione cellulare del midollo spinale, raccogliere i pezzi del midollo spinale nella parte inferiore del tubo. Sostituire HBSS con un millilitro di prosciutto F-10 medio e aggiungere dieci microlitri di tripina.Incubare il tubo per dieci minuti a 37 gradi Celsius. Per interrompere la digestione enzimatica, trasferire i frammenti in un nuovo tubo da 15 millilitri, contenente 800 microlitri di mezzo L-15 completo, 100 microlitri di 4%BSA e 100 microlitri di DNA e titolazione, due volte. Lasciare che i frammenti si sistemino per due minuti prima di raccogliere il supernatante in un tubo fresco da 15 millilitri.Aggiungere delicatamente due millilitri di 4%BSA nella parte inferiore del tubo supernatante. Centro fusibile a 470 x gravità per 5 minuti. Dopo 5 minuti, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pallet cellulare con 2 millilitri di mezzo L-15 completo.Per l'arricchimento del motoneurone, dividere la sospensione cellulare in due tubi da 15 millilitri. Quindi, aggiungere due millilitri di mezzo L-15 PH a ciascun tubo. Se si inizia con sei embrioni, utilizzare l'equivalente di tre embrioni per tubo e tre millilitri di mezzo.Aggiungere lentamente 2 millilitri di soluzione di grado di densità, sul fondo di ogni tubo per ottenere un'interfaccia nitida. Successivamente, centro fonderlo a 830 x gravità per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo questo passaggio, le piccole cellule dovrebbero essere nella parte inferiore del tubo, mentre le cellule di grandi dimensioni, come il motoneurone, dovrebbero essere alla soluzione gradiente di densità / interfaccia media.Asperae da 1 a 2 millilitri delle cellule all'interfaccia e trasferirle in un tubo fresco da 15 millilitri. Regolare il volume a dieci millilitri con mezzo L-15 PH. Successivamente, aggiungere due millilitri del cuscino 4%BSA sul fondo dei due tubi.E fusibile centro a 470 x gravità per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo 5 minuti, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pallet e 3 millilitri di mezzo L-15 completo. Ripetere il centrifugato a 470 x gravità per 5 minuti a temperatura ambiente.Quindi, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pallet cellulare e due millilitri di mezzo di coltura completo. Per coltura dei motoneuroni, diluirli a 5.000-10.000 cellule in 500 microlitri di mezzo di coltura per pozzo in una piastra di 24 pozzi. Quindi, rimuovere la soluzione di lamina con a punta di pipetta P-1,000.Trasferire immediatamente i motoneuroni diluiti nel mezzo di coltura. alle piastre di codifica per evitare l'asciugatura. Per preparare il DNA, sospendere di nuovo 1 microgrammo di DNA in 50 microlitri di terreno di coltura neuronale.E vortice per 5 secondi. Per preparare il tubo B, sospendere di nuovo 1,5 microlitri di perline in 50 microlitri di terreno di coltura neuronale. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di perline a 50 microlitri di soluzione di DNA e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.Durante questa incubazione, prelevare 100 microlitri di mezzo di coltura dal pozzo che verrà trasfetto. Successivamente, trasferire 100 microlitri del mix di perline di DNA ad ogni pozzo. E incubare la piastra di 24 pozzi, 20-30 minuti sulla piastra magnetica a 37 gradi Celsius.Qui è mostrata la morfologia dei neuroni moderna rivelata dalla posizione della catena pesante di neurofilamento non fosforilato endogeno dopo quattro giorni di coltura. In queste immagini, mostra la morfologia dei neuroni modem dopo quattro giorni in vitro e trasfettato per il gene trans EGFP per magnetofezione al secondo giorno. I neuroni motto erano contro-macchiati con il marcatore SMI-32 o il marcatore pan-neuro TUJ-1 e le frecce indicano il soma dei neuroni.Queste sono le loro immagini confocali di motoneuroni magneto influenzati, che esprimono costrutti NEFH di tipo selvaggio o mutante EGFP e macchiati per il loro marcatore autofagico LC-3B. Le frecce mostrano gli aggregati proteici mutanti EGFP NEFH che sono anche positivi all'LC-3B Seguendo questa procedura, montoholda curcha può essere analizzato mediante microscopia video per visualizzare il traffico di axon e aggiungere alcune linee guida. Dopo il suo sviluppo iniziale per affrontare questioni fondamentali in biologia neurale, questa tecnica si rivela anche un potente strumento per esplorare i meccanismi fisiopatologici che coinvolgono lo spettro dei disturbi del motoneurone, come la malattia da sindrome da shock tossico, la sclerosi laterale trofica samuele o l'atrofia muscolare spinale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Ricerca

Neuroscienze

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Rilevazione di placche neuritiche nel modello di malattia di Alzheimer mouse

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectina a base di isolamento e la coltura del mouse motoneuroni embrionali

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modellazione di cancerose Neural Invasion: La dorsale della radice Ganglio Modello

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Modellazione dell'ictus nei topi: lesioni corticali focali da fototrombosi

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...