Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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我々 は、「協会の流し込みル開発銀行デ ラ neurogénétique」博士 Jacquier の親睦と AFM テレソンの MyoNeurAlp 戦略的な計画を支援に感謝したいと思います。我々 はまた博士クリス ・ ヘンダーソン、博士ウィリアム ・ カムカム、博士ブリジット Pettmann、博士セドリック ラウルと博士のゲオルク Haase、開発および技術の改善に参加し、知識を広める人に感謝したいと思います。

動物を含むすべてのプロシージャは、機関の倫理委員会によって受け入れられました。
1. ソリューションの準備
<ol><li>4% BSA L-15 中透析の 10 mL を準備します。<ol>
<li>L-15 培地 10 mL に 4% (w/v) でのウシ血清アルブミンの粉を溶解します。</li>
		<li>20 kDa カットオフの 20 mL の透析カセットにソリューションを追加します。L-15 培地 500 mL に対して 4 ° C で動揺の下で 3 日間の dial...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

このプロトコルの重要なポイントの 1 つはマウス胚が開発 (E12.5) 末に得た MNs の量を最適化する時に正確な時間ウィンドウで解剖してです。また、最適な収率の解剖を実行朝または午後の早い段階でする必要があります。E12.5 (例えばE11.5 で)、前に郭清は髄膜の除去について特に困難です。E12.5 後、得られた MNs の数が大幅に低下します。開発の胚段階を制御するには、成人女性と男性?...

神経筋疾患には、様々 な筋肉や神経系の変化によって特徴付けられる臨床的に、遺伝的に異なる病態が含まれます。最後の十年の間に識別された何百ものこれらのまれな疾患の責任遺伝子の配列の技術が進歩したため (筋疾患センターで利用可能なリスト http://neuromuscular.wustl.edu/index.html)。識別された突然変異の様々 な異なった表現型と疾患1,2,3単一の遺伝子の異なる変異が発生することし、異なる遺伝子の突然変異が類似した表現型を作り出すことができることを示します4,5します。 このコンテキストでは、突然変異の結果、病理学的メカニズムを分析するための強力なツールになることができる細胞モデルの開発に取り組む。
脊髄 MNs 脊髄、骨格筋を対象と神経筋接合部におけるアセチルコリンのリリースを通して自主的な動きを可能にするフォーム長い軸索の腹側の角にある大きな細胞体があります。MNs は筋萎縮性側索硬化症などの神経筋疾患によって影響を受ける、同僚博士ヘンダーソンと脊髄性筋萎縮症、シャルコー ・ マリー ・ トゥース病 (CMT)、開発の耕作のために許可されて最初のプロトコル6in vitro における因子 GDNF7 (グリア細胞派生神経栄養因子) の脊髄 MNs と神経栄養因子の発見。脊髄 MNs と FACS8を使用してそのサブタイプのより正確な浄化のため許可されているそれ以来、技術的な改良が密度勾配による濃縮のまま強力かつ広く使用されているプライマリ脊髄 MNs 作業は現在研究所9,10,11,12,13,14します。 その後、表面マーカー p75(NTR)15,16,17を利用して immunopanning を通じて高い MN 精製グレードを得ることが可能ですも。
脊髄前角の背腹軸内の位置によって異なる中央と外側のモーター列だけでなく、胸椎、頸椎・腰椎の MNs の異なるサブタイプが含まれているし、目標の中で、彼らは8,を支配します。18. プライマリ MN 文化は生理学的な割合でこれらの MN のサブタイプのすべてを回復できます。この手法の主な制限は、MNs のプロシージャの終わりに取得数が少ない実際には、それが顕微鏡が生物化学実験用を制限することに適している六つの胚から約 105 MNs を取得する期待できます。標準化されたサブタイプと豊富な MNs 実験を行う (> 10 の6セル)、胚性幹細胞由来の MNs は、18を考慮すべき。
プライマリ MNs に野生型・変異遺伝子のノックダウンの内因性遺伝子トランスフェクションは、マウスモデルを使用できないときに特に physiopathological 経路を解読するための迅速かつ便利なツールです。Magnetofection は、株の一次ニューロンは、リポフェクション関連毒性なしと同様の技術のひとつです。さらに、いくつかの日に体外エレクトロポレーション9に基づく技術とは異なり、成熟したニューロンのトランスフェクションを実行できます。ただし、この方法の欠点の 1 つは、ビーズが文化、DAPI のラベル付けでノイズの原因で核酸をバインドです。ウイルス感染は株 MNs; の最も効率的な方法で可能性が高いしかし、magnetofection では、ウイルスの生産および細胞の感染に必要な特定の安全手順は必要ありません。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

(MNs) 脊髄運動ニューロンの変性は、すべて性筋萎縮症に関連付けられている筋萎縮性側索硬化症、シャルコー ・ マリー ・ トゥース病、脊髄性筋萎縮など神経学的障害の大きいスペクトルに関与しています。脊髄の MNs の初代培養は、このような病気に特異的な遺伝子の関与を示し、それらの変異体の細胞の結果を特徴付けるに広く使用されています。このプロトコル モデル主な MN 文化は 20 年以上も前にヘンダーソンと同僚の精液の仕事から派生します。まず、我々 はマウスの胚から脊髄の前方の角を解剖と隣接する密度勾配を利用した細胞から MNs を分離する方法を詳しく説明します。その後、効率的に magnetofection を用いた発現プラスミドを持つ MNs を株の新しい方法を提案する.最後に、我々 を修正する方法と immunostain プライマリ MNs。 ニューロ フィラメントをシャルコー ・ マリー ・ トゥース病のタイプ 2 を引き起こす突然変異を使用して、このプロトコルは、興味の蛋白質を表現することへの関与を勉強して質的な方法を示して説明します。ミネソタの増殖、保守、および生存。

文化で 24 時間後運動ニューロン (MNs) 既に重要な軸索の成長 (少なくとも 6 回以上相馬サイズ) が表示されます。次の日に軸索は成長し、分岐 (図 2) を表示し続ける必要があります。サブタイプ特異性により異なる形態があります。たとえば、中央列軸の筋肉を支配する MNs 肢筋肉18を支配する側のモーター柱 MNs より短くより分?...

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Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

この手法の目的は、一次運動ニューロン (MNs) マウスの脊髄からの高濃縮文化を準備することです。ミネソタ病気を引き起こす突然変異の結果を評価するために述べるこれらの分離が magnetofection で、トランスフェクションの MNs とを分離するここ。

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー ・ マリー ・ トゥース病の in Vitroモデル化

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

この方法は、運動ニューロンの極性、軸索誘導、軸索密売、神経変性メカニズムなどの神経生物学の重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、我々は分の愛情によって私たちのノックダウンタンパク質を表現するために取っている間、高度に豊かな運動ニューロン培養を得るです。この手順を開始するには、シリコンでコード化された解剖培地の皿に1つの胚を入れます。顕微鏡の下で、鉗子でシリコンに対して腹部を持つ胚を保持します。鉗子の第二のペアで、耳の先端の1つを、耳の脊髄の中央運河に挿入する。次いで、鉗子を閉じて、後部組織をわずかに引き裂く。脊髄全体が開くまで、コネル側に向かってこの操作を繰り返します。次に、開いた脊髄がシリコンに対して行われたように胚を位置づける。続いて、脊髄のロストラッド部分を身体から取り外す。脊髄のロストラッド部分をつまみ、頭で胚を引っ張って脊髄を抽出する。残りの髄やDRGを脊髄に取り付け、慎重に引き離します。シリコン上の脊髄を平らにし、メスを使用して、各側の中央に沿って切断することによって、コードの裏側半分を取り除きます。中央部分を10個に切り、新しいチューブに移します。脊髄細胞懸濁液を調製するには、チューブの底部にある脊髄片を採取する。HBSSをハムF-10培地の1ミリリットルに置き換え、トリプシンを10マイクロリットル加えます。37°Cで10分間チューブをインキュベートします。酵素消化を停止するには、完全なL-15培地の800マイクロリットル、4%BSAの100マイクロリットル、および100マイクロリットルのDNAと硝酸塩を含む新しい15ミリリットルチューブに断片を2回移す。新鮮な15ミリリットルのチューブに上清を収集する前に、断片を2分間落ち着かせてください。上清チューブの底部に4%BSAの2ミリリットルをそっと加えます。セントロは470×重力で5分間融合します。5分後、上清を取り外し、完全なL-15培地の2ミリリットルでセルパレットを再中断します。モトニューロンの濃縮のために、細胞懸濁液を2つの15ミリリットルチューブに分割します。次に、各チューブにL-15 PH培地を2ミリリットル加えます。6つの胚から始める場合は、チューブあたり3つの胚と3ミリリットルの培地に相当するものを使用してください。各チューブの底部に2ミリリットルの密度のグラデーション溶液をゆっくりと加える。次に、セントロは室温で15分間830 x重力でそれを融合させる。このステップの後、小さな細胞はチューブの底にあるべきですが、モトニューロンのような大きな細胞は密度勾配溶液/ミディアムインターフェースでなければなりません。界面で細胞の1〜2ミリリットルをアスペラエし、新鮮な15ミリリットルのチューブに移す。L-15 PH培地で10ミリリットルに音量を調整します。続いて、4%BSAクッションの2ミリリットルを2本のチューブの底に加えます。そして、セントロは室温で5分間470×重力で融合します。5分後、上清を取り外し、パレットと3ミリリットルの完全なL-15培地を再び中断します。470 x 重力で遠心分離物を室温で 5 分間繰り返します。次いで、上清を取り出し、完全な培養培地のセルパレットと2ミリリットルを再懸濁させた。運動ニューロンを培養するには、24ウェルプレートで500マイクロリットルの培養培地で5,000-10,000細胞に希釈する。次に、P-1,000ピペットチップで薄層溶液を取り除きます。すぐに培養培地で希釈された運動ニューロンを移す。乾燥を避けるためにコーディングプレートに。DNAを調製するために、50マイクロリットルの神経細胞培養培地中のDNA1マイクログラムを再懸濁させる。そして5秒間渦。B管を調製するために、1.5マイクロリットルのビーズを50マイクロリットルの神経培養培地に再懸濁させる。50マイクロリットルのDNA溶液に50マイクロリットルのビーズ溶液を加え、室温で20分間インキュベートします。このインキュベーションの間に、トランスフェクションされる井戸から100マイクロリットルの培養培地を引き出す。続いて、100マイクロリットルのDNAビーズミックスを各ウェルに移す。そして、摂氏37度で磁板に20〜30分、24ウェルプレートをインキュベートします。ここに示されているのは、4日間培養した後の内因性非リン酸化ニューロフィラメント重鎖の立ち上がることによって明らかにされるモデムニューロン形態である。これらの画像では、2日目にインビトロで4日後にモデムニューロンの形態を示し、2日目にマグネフェクションによってEGFPトランス遺伝子にトランスフェクトした。モットーニューロンは、マーカーSMI-32または汎神経マーカーTUJ-1で対染色され、矢印はニューロンのソーマを示す。これらは磁気感染運動ニューロンの共焦点画像であり、野生型または変異体EGFP NEFHを発現し、オートファジーマーカーLC-3Bに染色される。矢印は、この手順に従ってLC-3B陽性でもある変異体EGFP NEFHタンパク質凝集体を示し、モントホルダ・キュラチャは、軸索密売を視覚化し、いくつかのガイダンスを追加するためにビデオ顕微鏡で分析することができる。神経生物学の基本的な問題に対処するための最初の開発後、この技術はまた、毒性ショック症候群疾患、サミュエル栄養性側索硬化症、または脊髄性筋萎縮症などのモトニューロン障害のスペクトルに関係する生理学的メカニズムを探求するための強力なツールであることを証明する。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

アルツハイマー病のマウスモデルにおける神経突起斑の検出

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

マウス胚の運動ニューロンのレクチンに基づく分離と文化

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

マウスにおける脳卒中のモデリング:光血栓症による焦点性皮質病変

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー ・ マリー ・ トゥース病の in Vitroモデル化

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー・マリー・トゥース病の in Vitroモデル化