Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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우리는 "협회 부 르 지속 가능성 드 라 neurogénétique" 박사 Jacquier의 친목 및 AFM-텔 레 톤 MyoNeurAlp 전략적 계획을 통해 그것의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 박사 크리스 헨 더 슨, 박사 윌리엄 Camu, 박사 Brigitte Pettmann, 박사 세 드 릭 라울, 누가 개발 하 고 기술 향상에 참가 하 고 그들의 지식을 전파 하는 박사 게오르그 세 감사 하 고 싶습니다.

동물 관련 된 모든 절차는 기관의 윤리 위원회에 의해 허용 했다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>4% BSA L-15 매체에 dialyzed의 10 mL를 준비 합니다.<ol>
<li>L-15 매체의 10 mL에 4% (w/v)에 소 혈 청 알 부 민 분말을 용 해.</li>
		<li>20 mL 투 카세트 20 kDa 커트 오프로에 솔루션을 추가 합니다. 4 ° c.에 동요에서 3 일 동안 L-15 매체의 500 mL에 대 한 dialyze L-15 매체 매일 변경 합니다.</li>
		<li>0.22 μ m 막 및 ...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

이 프로토콜에서 중요 한 포인트 중 하나는 마우스 배아는 개발 (E12.5) 끝에 얻은 MNs의 양을 최적화 하는 동안 정확한 시간대에 해 부입니다. 또한, 최적의 생산량에 대 한 해 부 수행 되어야 한다 아침 이나 이른 오후에. E12.5 (예를 들어, E11.5에서), 전에 해 부가 어렵습니다, 특히 meninges의 제거에 관한. E12.5, 후 얻은 MNs의 수는 크게 떨어진다. 개발의 배아 단계 제어, 성인 여성 및 남성 처음 배...

신경 근육 학 질병 근육 및 신경 시스템의 변경에 의해 특징은 임상 및 유전으로 명료한 pathologies의 다양 한을 포함 됩니다. 시퀀싱 기술 발전, 때문에 유전자가 희귀 질환에 대 한 책임의 수백 지난 10 년 동안 확인 되었습니다 (Neuromuscular 질병 센터에서 사용할 수 있는 목록 http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). 확인 된 돌연변이의 다양 한 다른 고기 및 질병1,,23 다른 돌연변이 단일 유전자에서 발생할 수 있습니다 나타내고 다른 유전자에 돌연변이 비슷한 고기를 생산할 수 있는 4 , 5. 이러한 맥락에서 돌연변이 결과 및 병 적인 메커니즘을 분석 하기 위한 강력한 도구가 될 수 있는 휴대 전화 모델을 개발 하는 노력 있다.
척추 MNs는 척수의 복 부 뿔 형태 긴 축 삭 골격 근육 섬유를 타겟으로하 고 신경 근육 접합부에서 아 세 틸 콜린의 출시를 통해 자발적인 움직임에 대 한 허용에 있는 큰 somas는. MNs는 루 경화 증, Charcot Marie이 질병 (CMT), 신경 근육 학 질병에 의해 영향을 때문에 척추 근육 위축, 닥터 헨 더 슨과 동료 의 재배에 대 한 허용 된 첫 번째 프로토콜6 개발 생체 외에서 척추 MNs 및 科의 발견 요소 GDNF7 (glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인). 그 이후 기술 상세 척추 MNs 및 FACS8를 사용 하 여 그들의 하위의 더 정확한 정화에 대 한 허용 하지만 밀도 그라데이션에 의해 농축 남아 기본 척추 MNs 작업은 현재 실험실에서 강력 하 고 널리 사용 되 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 그 후, 그것은 또한 표면 마커 p75(NTR)15,,1617의 활용 하 여 immunopanning 통해 높은 미네소타 정화 등급을 얻을 수.
척수 포함 dorso 복 부 축에 전방 경적에서 그들의 위치 사이에서 다른 중간과 측면 모터 열으로 자 궁 경부, 흉부, 요 추 MNs의 다른 하위 및 표적 중 그들은 자극8, 18. 주 미네소타 문화 생리 적인 비율에 이러한 미네소타의 모든를 복구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 한계는 프로시저;의 끝에 얻은 MNs의 낮은 수 사실, 그것은 현미경 검사 법 그러나 생화학 실험에 대 한 제한에 대 한 적당 한 6 개의 배아에서 약 105 MNs를 얻을 것으로 예상 수 있습니다. 더 표준화 된 하위와 풍부한 MNs 실험을 수행 하기 위해 (> 106 셀), 배아 줄기 세포 유래 MNs18고려 되어야 한다.
기본 MNs로 야생-타입/돌연변이 transgenes 또는 최저의 내 생 유전자의 transfection는 특히 마우스 모델 사용할 수 없을 때 physiopathological 경로 해독에 대 한 신속 하 고 유용한 도구입니다. Magnetofection은 transfecting 기본 신경, 관련된 neurotoxicity 없이 lipofection와 비슷한 하나의 기술입니다. 또한, 몇 일 후 체 외에서electroporation9에 따라 기술 달리 성숙한 뉴런에 transfection은 수행할 수 있습니다. 그러나, 한이 기술의 단점은 구슬 DAPI 라벨에 잡음을 일으키는 문화에서 핵 산 바인딩입니다. 바이러스 감염 가능성이 transfecting MNs;에 대 한 가장 효율적인 기술 이다 그러나, magnetofection는 바이러스 생산 및 세포 감염에 필요한 특정 안전 절차를 필요 하지 않습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

척추 motoneurons (MNs)의 Neurodegeneration 등 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, 척추 근육 위축, 근육 위축과 모두 관련 된 신경 성 질환의 큰 스펙트럼에 연루 이다. 척추 MNs의 기본 문화 같은 질병에 특정 한 유전자의 관련을 설명 하 고 그들의 변이의 세포 결과 특성화에 널리 사용 되어 왔습니다. 이 프로토콜 모델 기본 미네소타 문화 파생 헨 더 슨과 동료의 정액 일에서 20 년 이상 전에. 첫째, 우리는 마우스 배아에서 척수의 앞쪽 뿔을 해 부하 고 밀도 그라디언트를 사용 하 여 셀을 이웃에서 MNs를 분리 하는 방법 선발. 다음, 우리는 효율적으로 magnetofection를 사용 하 여 식 플라스 미드와 MNs를 transfecting의 새로운 방법을 제시. 마지막으로, 우리는 수정 하는 방법과 immunostain MNs. Charcot Marie이 질병 유형 2 원인 neurofilament 변이 사용 하 여,이 프로토콜 하 관심사의 단백질을 표현 하 고 있는 그들의 관련을 공부 질적 방법을 보여 주 설명 미네소타, 유지 보수, 성장과 생존입니다.

24 시간 후 문화에서, motoneurons (MNs) 이미 상당한 axonal 성장 (적어도 6 시간 이상 소마 크기)을 표시 합니다. 다음 일에 축 삭 성장 분기 (그림 2)를 표시 하 고 계속 해야 합니다. 하위 특이성으로 인해 다른 형태학을 있을 것입니다. 예를 들어 중간 열 MNs 축 근육을 자극 하는 자극 다리 근육18측면 모터 열 MNs 보다 짧고 더 분기 축 삭을 ?...

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Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

이 기법의 목표는 murine 척수에서 기본 motoneurons (MNs)의 매우 풍부한 문화를 준비. 설명만 질병을 일으키는 돌연변이의 결과 평가 하려면 여기 이러한 격리 절연 MNs 및 그들의 transfection magnetofection에 의해.

마우스 기본 Motoneurons Transfecting으로 Charcot Marie이 질병에서 체 외에서 모델링

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

이 방법은 운동 신경 극성, 축축기 지도, 축축한 인신 매매 및 신경 퇴행성 메커니즘과 같은 신경 생물학의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 분 애정으로 우리의 녹다운 단백질을 표현하는 동안 고도로 농축 된 운동 신경 문화를 얻는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 실리콘으로 코딩 된 해부 미디어 접시에 하나의 배아를 놓습니다.현미경의 밑에, 집게로 실리콘에 대하여 복부로 태아를 붙들기. 두 번째 집게를 사용하여 로스트라드 척수의 중앙 운하에 팁 중 하나를 삽입합니다. 그런 다음 집게를 닫아 등조직을 약간 찢습니다.전체 척수가 열릴 때까지 코넬 측으로 이 수술을 반복합니다. 다음으로, 열린 척수가 실리콘에 대항할 수 있도록 배아를 배치합니다. 그 후, 몸에서 척수의 로스트라드 부분을 분리.척수의 로스트라드 부분을 꼬집어 머리에 배아를 당겨 척수를 추출합니다. 척수에 부착된 남은 수막과 DRG를 조심스럽게 꺼냅니다. 실리콘에 척수를 평평하게하고 메스를 사용하여 각 면의 중간을 따라 절단하여 코드의 등쪽 절반을 제거합니다.중간 부분을 10개로 자르고 새로운 튜브로 옮습니다. 척수 세포 현탁액을 준비하려면 튜브 바닥에 있는 척수 조각을 수집하십시오. HBSS를 Ham F-10 배지 의 1밀리리터로 대체하고 트립신 10마이크로리터를 추가합니다.37도에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 효소 소화를 막기 위해 조각을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮기고, 전체 L-15 배지 800마이크로리터, 4%BSA의 100마이크로리터, DNA 및 티타테산 100마이크로리터를 2회 나타낸다. 신선한 15 밀리리터 튜브에서 상체를 수집하기 전에 파편이 2 분 동안 정착하게하십시오.상체 튜브 의 바닥에 4 %BSA의 2 밀리리터를 부드럽게 추가합니다. 센트로는 470 x 중력으로 5분간 융합합니다. 5 분 후, 상체를 제거하고 완전한 L-15 배지의 2 밀리리터로 셀 팔레트를 다시 중단하십시오.모토뉴런 농축을 위해 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브 2개로 나눕힙시다. 그런 다음 각 튜브에 L-15 PH 배지 의 2 밀리리터를 추가합니다. 6개의 태아로 시작하는 경우에, 관 당 3개의 태아및 매체의 3개의 밀리리터의 동등한를 이용합니다.밀도 그라데이션 용액 2 밀리리터를 각 튜브의 바닥에 천천히 추가하여 선명한 인터페이스를 얻습니다. 다음으로, 센트로는 실온에서 15 분 동안 830 x 중력으로 융합합니다. 이 단계 후, 작은 세포는 튜브의 바닥에 있어야하는 반면, 모토뉴런과 같은 큰 세포는 밀도 그라데이션 용액/중간 인터페이스에 있어야 한다.아스페라에 1 ~ 2 인터페이스에서 세포의 밀리리터와 신선한 15 밀리 리터 튜브로 전송. L-15 PH 배지로 10밀리리터로 볼륨을 조정합니다. 그 후, 두 개의 튜브의 바닥에 4 %BSA 쿠션의 두 밀리리터를 추가합니다.그리고 센트로는 실온에서 5 분 동안 470 x 중력에서 융합됩니다. 5분 후, 상류체를 제거하고 팔레트와 완전한 L-15 배지 3밀리리터를 다시 중단합니다. 원심분리기를 470 x 중력에서 실온에서 5분간 반복합니다.그런 다음, 상체를 제거하고 셀 팔레트와 완전한 배양 배지의 2 밀리리터를 다시 중단한다. 운동 뉴런을 배양하기 위해, 24웰 플레이트에서 잘 배양 배지의 500 마이크로리터에 5, 000-10, 000 세포로 희석한다. 그런 다음 P-1, 000 파이펫 팁으로 라미네 솔루션을 제거합니다.배양 배지에서 희석된 모터 뉴런을 즉시 이송합니다. 건조를 피하기 위해 코딩 플레이트에. DNA를 준비하기 위하여는, 신경 배양 배지의 50의 마이크로리터에 있는 DNA의 1 마이크로그램을 다시 중단합니다.그리고 5 초 동안 소용돌이. B 튜브를 준비하려면, 뉴런 배양 배지의 50 마이크로 리터에서 구슬의 1.5 마이크로 리터를 다시 중단합니다. 50 마이크로리터의 비드 용액을 DNA 용액 50마이크로리터에 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.이 잠복기 동안, 전형될 우물에서 배양 배지의 100 마이크로리터를 철회한다. 그 후, DNA 비드 믹스의 100 마이크로리터를 각각 양으로 전달한다. 그리고 24 웰 플레이트, 37섭씨에서 자기 판에 20-30 분을 배양합니다.여기에 표시된 모뎀 뉴런 형태는 4 일간의 배양 후 내인성 비 인성 신경 필라멘트 무거운 사슬의 서서에 의해 밝혀지는 모뎀 뉴런 형태입니다. 이러한 이미지에서, 체외에서 4일 후 모뎀 뉴런 형태를 보여주고 둘째 날에 자기에 의해 EGFP 트랜스 유전자에 대한 형질전환. 모토 뉴런은 마커 SMI-32 또는 범신경 마커 TUJ-1로 반염색되었고 화살표는 뉴런의 소마를 나타낸다.이들은 자기 감염 모터 뉴런의 그들의 공초점 심상입니다, 야생 모형 또는 돌연변이 EGFP NEFH 구조물을 표현하고 그들의 자기 변색 마커 LC-3B를 위해 염색됩니다. 화살표는 또한 LC-3B 양성 돌연변이 EGFP NEFH 단백질 골재가 이 절차에 따라, 몬톨다 큐차는 축슨 인신 매매를 시각화하고 몇 가지 지침을 추가하기 위해 비디오 현미경 검사법에 의해 분석 될 수있다. 신경 생물학에 있는 근본적인 질문을 해결하기 위하여 그것의 초기 발달 후에, 이 기술은 또한 독성 충격 증후군 질병, 새뮤얼 트로피측 경화증, 또는 척추 근육 위축과 같은 motoneuron 무질서의 스펙트럼을 연루하는 물리 병리학 적인 기계장치를 탐구하는 강력한 공구인 것을 증명합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

알츠하이머 질병 마우스 모델에서 Neuritic Plaques의 감지

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

마우스 배아의 Motoneurons의 렉틴 기반 격리와 문화

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

등쪽 뿌리 신경절 모델 : 암성 신경 침략의 생체 외 모델링에서

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

마우스에서 뇌졸중 모델링: 포심 피질 병변

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...