Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Vi ønsker å takke den "Association helle le développement de la neurogénétique" Dr. Jacquiers fellesskap og AFM-Telethon for støtte gjennom MyoNeurAlp strategisk plan. Vi vil også gjerne takke Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul og Dr. Georg Haase, som deltok i utvikle og forbedre teknikken og spre kunnskap.

Alle prosedyrer som involverer dyr ble akseptert av den etiske komiteen ved institusjonen.
1. løsning forberedelse
<ol><li>Forberede 10 mL av 4% BSA dialyzed L-15 medium.<ol>
<li>Oppløse bovin serum albumin pulver på 4% (w/v) i 10 mL av L-15 medium.</li>
		<li>Legger til løsningen på en 20 mL dialyse bånd med en 20 kDa cut-off. Dialyze mot 500 mL L-15 medium for 3 dager under omrøring på 4 ° C. Endre L-15 mediet hver dag.</li>
		<li>Filtrere løsningen gjennom en 0.22 µm membranen ...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

En av de kritiske punktene i denne protokollen er at de mouse embryoene er dissekert på en presis vinduet under utvikling (E12.5) å optimalisere mengden MNs på slutten. I tillegg for optimal avkastning, skal dissection utføres i morgen eller tidlig på ettermiddagen. Før E12.5 (f.eks på E11.5) er disseksjon vanskelig, spesielt om eliminering av meninges. Etter E12.5 drops antall innhentet MNs betydelig. For å kontrollere embryoet utviklingstrinn, plasseres voksne hunner og hanner først sammen på slutten...

Neuromuscular sykdommen omfatter en rekke klinisk og genetisk distinkte patologi som kjennetegnes ved endring av muskler og/eller nervesystemet. På grunn av fremskritt i sekvensering teknologi, hundrevis av gener ansvarlig for disse sjeldne diagnoser har blitt identifisert i løpet av det siste tiåret (liste tilgjengelig på Neuromuscular sykdommen Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Ulike identifiserte mutasjoner angir at ulike mutasjoner i et enkelt gen kan føre til Norge og sykdommer1,2,3 og at mutasjoner i ulike gener kan produsere lignende fenotyper 4 , 5. i denne sammenheng er det innsats for å utvikle mobilnettet modeller som kan bli kraftig verktøy for å analysere mutasjon konsekvenser og patologisk mekanismer.
Spinal MNs har stor somas ligger i den ventral horn i ryggmargen, skjemaet lang axons å målrette skjelettlidelser muskel fiber, og tillate frivillig bevegelser gjennom utgivelsen av acetylcholine på nevromuskulær veikryss. Siden MNs påvirkes av nevromuskulær sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom (CMT), og spinal muskel atrofi, Dr. Henderson og kolleger utviklet den første protokoll6 som er tillatt for dyrking av i vitro spinal MNs og oppdagelsen av nevrotropisk faktor GDNF7 (glial celle avledet nevrotropisk faktor). Tekniske forbedringer siden da har tillatt for mer nøyaktig rensing av spinal MNs og undertypene bruker FACS8, men berikelse av tetthet gradert fortsatt kraftig og mye brukt i laboratorier jobber med primære spinal MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. deretter er det også mulig å få en høyere MN rensing karakter gjennom immunopanning ved å utnytte overflaten markør p75(NTR)15,16,17.
Ryggmargen inneholder forskjellige undergrupper av cervical thorax og lumbale MNs, samt median og lateral motor kolonner som varierer plasseringen i det fremre Hornet på en dorso-ventrale akse og blant målene de innervate8, 18. primære MN kulturer kan gjenopprette alle disse MN subtyper i fysiologiske forhold. Den viktigste begrensningen av denne teknikken er lavt antall MNs på slutten av prosedyren; Faktisk, kan det forventes å få rundt 105 MNs fra seks embryo, som er egnet for mikroskopi men begrensende for biokjemi eksperimenter. Utføre eksperimenter med mer standardiserte subtyper og rikelig MNs (> 106 celler), embryonale Stamcelle-avledet MNs anses18.
Hva av vill-type/mutant effekter av transgener eller pusse endogene gener i primære MNs er en rask og nyttig verktøy for tyde physiopathological veier, spesielt når musen modeller er utilgjengelig. Magnetofection er en teknikk for transfecting primære neurons, ligner lipofection uten den relaterte nevrotoksisitet. Videre, hva kan utføres på modne nevroner etter flere dager i vitro, i motsetning til teknikker basert på electroporation9. En ulempe med denne teknikken er imidlertid at perlene binde nukleinsyrer i kultur, forårsaker støy i DAPI merking. Virusinfeksjon er trolig den mest effektive metoden for transfecting MNs; magnetofection krever imidlertid ikke bestemte prosedyrer nødvendig for viral produksjon og mobilnettet infeksjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Neurodegeneration av spinal motoneurons (MNs) er involvert i et stort spekter av nevrologiske lidelser inkludert amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom og spinal muskel atrofi, som er alle forbundet med muskel atrofi. Primære kulturer av spinal MNs har brukt mye å demonstrere involvering av bestemte gener i slike sykdommer og karakterisere mobilnettet konsekvensene av deres mutasjoner. Denne protokollen modeller en primær MN kulturen avledet fra banebrytende arbeid Henderson og kolleger mer enn tjue år siden. Først detalj vi en metode for dissekere den fremre horn i ryggmargen fra en mus embryoet og isolere MNs fra nærliggende celler med en tetthet gradering. Deretter presenterer vi en ny måte å effektivt transfecting MNs med uttrykket plasmider bruker magnetofection. Til slutt, vi illustrere hvor å fastsette og immunostai primære MNs. bruke neurofilament mutasjoner som forårsaker Charcot-Marie-Tooth sykdom type 2, denne protokollen demonstrerer en kvalitativ tilnærming til uttrykke proteiner av interesse og studere deres engasjement i MN vekst, vedlikehold og overlevelse.

Etter 24 timer i kultur, bør motoneurons (MNs) allerede viser betydelig axonal vekst (minst 6 ganger lengre enn soma). I de følgende dagene, bør axons fortsette å vokse og vise forgrening (figur 2). Det vil være ulike morphologies på grunn av undertype særegenheter. For eksempel median kolonnen MNs som innervate aksial musklene har kortere og mer forgrenet axons enn lateral motor kolonnen MNs som innervate lem muskler18.
<p ...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Målet med denne teknikken er å forberede en høyanriket kultur for primære motoneurons (MNs) fra murine ryggmargen. For å vurdere konsekvensene av mutasjoner forårsaker MN sykdommer, beskriver vi her isolasjon av dette isolerte MNs og deres transfection av magnetofection.

Modellering Charcot-Marie-Tooth sykdom In Vitro av Transfecting musen primære Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Denne metoden kan bidra til å løse viktige spørsmål i nevrobiologi, som motor neuron polaritet, axon veiledning, axon trafficking, og nevrodegenerative mekanismer. Den største fordelen med denne teknikken er å oppnå en svært beriket motor neuron kultur mens vi tar for å uttrykke vår knockdown protein for minutt hengivenhet. For å begynne denne prosedyren, legg ett embryo i en tallerken med disseksjonsmedier kodet med silisium.Under mikroskopet holder du embryoet med magen mot silisiumet med tang. Med det andre paret tang, sett inn en av spissene i den sentrale kanalen i rostrad ryggmargen. Lukk deretter tangen for å rive dorsalvevet litt.Gjenta denne operasjonen mot connell-siden til hele ryggmargen åpnes. Deretter plasserer du embryoet slik at den åpne ryggmargen er mot silisium. Deretter løsner du rostrad-delen av ryggmargen fra kroppen.Klyp rostrad-delen av ryggmargen, og trekk embryoet i hodet for å trekke ut ryggmargen. Trekk forsiktig bort eventuelle gjenværende meninges og DRGs fortsatt festet til ryggmargen. Flat ryggmargen på silisium og bruk en skalpell, fjern den ryggemessige halvdelen av ledningen ved å kutte langs midten av hver side.Skjær den midterste delen i ti stykker, og overfør dem til et nytt rør. For å forberede ryggmargscelleoppheng, samle ryggmargsbitene nederst på røret. Erstatt HBSS med en milliliter Skinke F-10 medium og tilsett ti mikroliter trypsin.Inkuber røret i ti minutter ved 37 grader Celsius. For å stoppe den enzymatiske fordøyelsen, overfør fragmentene til et nytt 15 milliliter rør, som inneholder 800 mikroliter med komplett L-15 medium, 100 mikroliter på 4% BSA og 100 mikroliter dnaer og titrat, to ganger. La fragmentene bosette seg i to minutter før du samler supernatanten i et friskt 15 milliliter rør.Tilsett forsiktig to milliliter på 4% BSA nederst på det overnaturlige røret. Centro smelter den på 470 x tyngdekraften i 5 minutter. Etter 5 minutter, fjern supernatant og re-suspendere cellepallen med 2 milliliter med komplett L-15 medium.For motoneuron berikelse, del cellesuspensjonen i to 15 milliliter rør. Deretter legger du til to milliliter L-15 PH medium til hvert rør. Hvis du starter med seks embryoer, bruk tilsvarende tre embryoer per rør, og tre milliliter medium.Legg langsomt til 2 milliliter tetthetsgraderingsløsning, til bunnen av hvert rør for å oppnå et skarpt grensesnitt. Deretter sikring centro den på 830 x tyngdekraften i 15 minutter ved romtemperatur. Etter dette trinnet bør små celler være på bunnen av røret, mens store celler- som motoneuron-bør være på tetthet gradient løsning / medium grensesnitt.Asperae 1 til 2 milliliter av cellene i grensesnittet og overføre dem til en frisk 15 milliliter tube. Juster volumet til ti milliliter med L-15 PH medium. Deretter legger du til to milliliter av 4% BSA pute til bunnen av de to rørene.Og centro sikring på 470 x tyngdekraften i 5 minutter ved romtemperatur. Etter 5 minutter, fjern supernatant og re-suspendere pallen og 3 milliliter med komplett L-15 medium. Gjenta centrifugate ved 470 x tyngdekraften i 5 minutter ved romtemperatur.Deretter fjerner du den overnaturlige og re-suspendere cellepallen og to milliliter med komplett kulturmedium. Til kultur motoriske nevroner, fortynne dem til 5, 000-10, 000 celler i 500 mikroliter kultur medium per brønn i en 24 brønnplate. Fjern deretter laminaeløsningen med på P-1 000 pipetspissen.Overfør umiddelbart motornevronene fortynnet i kulturmedium. kodeplatene for å unngå tørking. For å forberede DNA, re-suspendere 1 mikrogram DNA i 50 mikroliter av nevronal kultur medium.Og virvel i 5 sekunder. For å forberede B-røret, re-suspendere 1,5 mikroliter perler i 50 mikroliter av nevronal kultur medium. Tilsett 50 mikroliter perleoppløsning til 50 mikroliter DNA-løsning og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.Under denne inkubasjonen trekker du 100 mikroliter kulturmedium fra brønnen som vil bli transfisert. Deretter overfører du 100 mikroliter av DNA-perlen til hver brønn. Og inkubere 24 brønnplaten, 20-30 minutter på magnetplaten ved 37 grader Celsius.Vist her, er modemet neuron morfologi avslørt ved å stå av endogene ikke-fosforylert neurofilament tung kjede etter fire dager med kultur. I disse bildene, vise modemet neuron morfologi etter fire dager in vitro og transfected for EGFP trans genet ved magnetofection på dag to. Motto nevroner ble motfarget med markøren SMI-32 eller pan-neuro markør TUJ-1 og pilene indikerer soma av nevronene.Dette er deres konfokale bilder av magneto infiserte motornevroner, som uttrykker vill type eller mutant EGFP NEFH konstruerer og farget for deres autofagiske markør LC-3B. Piler viser muterte EGFP NEFH proteinaggregater som også er LC-3B positive Etter denne prosedyren kan montoholda curcha analyseres via videomikroskopi for å visualisere axonhandel og legge til litt veiledning. Etter sin første utvikling for å løse grunnleggende spørsmål i nevrale biologi, denne teknikken viser seg også å være et kraftig verktøy for å utforske fysio patologiske mekanismer som impliserer spekteret av motoneuron lidelser, som giftig sjokk syndrom sykdom, samuel trofisk lateral sklerose, eller spinal muskelatrofi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Påvisning av Microregional Hypoksi i Mus Cerebral Cortex av to-foton Imaging av endogen NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In vitro modellering av kreft Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering Neuronal død og forverring av musen primære lillehjernen Granule nerveceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering og isolering av musen primære Microglia av tetthet gradert sentrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rask og spesifikk Immunomagnetic isolasjon av musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal Differensiering fra mus embryonale stamceller In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Modelleringsslag hos mus: Brennvide kortikale lesjoner ved fototrombose

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...