Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a "Association pour le développement de la neurogénétique" para comunhão e AFM-Teleton do Dr. Jacquier seu apoio através do plano estratégico de MyoNeurAlp. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul e Dr. Georg Haase, que participaram de desenvolver e melhorar a técnica e difundir seus conhecimentos.

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aceites pelo Comité de ético da instituição.
1. preparação da solução
<ol><li>Prepare-se 10 mL de 4% de que BSA diálise no meio de L-15.<ol>
<li>Dissolva o pó de albumina de soro bovino em 4% (p/v) em 10 mL de meio de L-15.</li>
		<li>Adicione a solução para uma gaveta de diálise de 20 mL com um disco de corte 20 kDa. Dialize contra 500 mL do meio de L-15 por 3 dias sob agitação a 4 ° C. Altere o meio de L-15 todos os dias.</l...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

Um dos pontos críticos no presente protocolo é que os embriões de rato são dissecados em uma janela de tempo preciso durante o desenvolvimento (E12.5) para otimizar a quantidade de MNs obtidos no final. Além disso, para um rendimento ideal, a dissecação deve ser realizada pela manhã ou no início da tarde. Antes de E12.5 (por exemplo, em E11.5), a dissecação é difícil, principalmente no que tange a eliminação das meninges. Depois de E12.5, o número de MNs obtidos cai significativamente. Para contr...

Doenças neuromusculares englobam uma variedade de patologias clinicamente e geneticamente distintas que caracterizam-se pela alteração do músculo e/ou o sistema nervoso. Devido aos avanços nas tecnologias de sequenciamento, centenas de genes responsáveis por estas doenças raras foram identificadas durante a última década (lista disponível no centro de doença Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). A variedade de mutações identificadas indica que diferentes mutações em um único gene podem causar diferentes fenótipos e doenças1,2,3 e que mutações em genes diferentes podem produzir fenótipos similares 4 , 5. neste contexto, há esforços para desenvolver modelos de celulares que podem se tornar poderosas ferramentas para analisar as consequências de mutação e mecanismos patológicos.
MNs espinhais tem grandes somas localizados nos cornos ventrais da medula espinhal, axônios longos de formulário de fibras musculares esqueléticas de destino e permitir movimentos voluntários através da liberação de acetilcolina na junção neuromuscular. Desde MNs são afetados por doenças neuromusculares como esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth (CMT), e atrofia muscular espinhal, Dr. Henderson e colegas desenvolveram o primeiro protocolo6 permitidos para cultivo de in vitro MNs da coluna vertebral e a descoberta de neurotrophic factor GDNF7 (fator neurotrófico derivado de célula glial). Refinamentos técnicos desde então têm permitido para purificação mais precisa de MNs da coluna vertebral e seus subtipos usando FACS8, mas o enriquecimento por gradiente de densidade permanece poderosa e amplamente utilizado em laboratórios, atualmente trabalhando com MNs espinhais primários 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. posteriormente, também é possível obter um maior grau de purificação MN através de immunopanning, tirando proveito do marcador de superfície p75(NTR)15,16,17.
A medula espinhal contém diferentes subtipos de MNs cervicais, torácicas e lombares, bem como medianos e laterais motor as colunas que diferem entre sua localização no Corno anterior em um eixo dorso-ventral e entre os alvos que eles inervam8, 18. culturas primárias MN podem recuperar todos esses subtipos de MN em proporções fisiológicas. A principal limitação dessa técnica é o baixo número de MNs obtidos ao final do procedimento; na verdade, pode presumir-se obter em torno de 105 MNs de seis embriões, que é apropriada para a microscopia, mas limitando para experimentos de bioquímica. A realizar experimentos com mais padronizados subtipos e MNs abundantes (> 106 células), embrionárias MNs de células-tronco derivadas devem ser considerados18.
Transfection do selvagem-tipo/mutante transgenes ou knockdown genes endógenos em MNs primários é uma ferramenta rápida e útil para decifrar vias fisiopatológicas, especialmente quando modelos de rato não estão disponíveis. Magnetofection é uma técnica para transfecting os neurônios primários, semelhantes ao lipofection sem a neurotoxicidade relacionada. Além disso, transfecção pode ser executada em neurônios maduros depois de vários dias em vitro, ao contrário de técnicas baseadas em electroporation9. No entanto, uma desvantagem dessa técnica é que os grânulos ligam a ácidos nucleicos na cultura, causando barulho na rotulagem de DAPI. Infecção viral é provavelmente a técnica mais eficiente para MNs transfecting; no entanto, magnetofection não requer determinados procedimentos de segurança necessários para a produção viral e infecção celular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Neurodegeneração de motoneurônios da coluna vertebral (MNs) está implicada em um grande espectro de doenças neurológicas, incluindo a esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth e atrofia muscular espinhal, que são todos associados com atrofia muscular. Culturas primárias de MNs espinhais têm sido usadas amplamente para demonstrar o envolvimento de genes específicos em tais doenças e caracterizar as consequências celulares de suas mutações. Esta cultura de modelos um primário MN protocolo derivada do trabalho seminal de Henderson e colegas há mais de vinte anos. Primeiro, detalhamos um método de dissecar os cornos anteriores da medula espinhal de um embrião de rato e isolando os MNs de vizinhas células usando um gradiente de densidade. Em seguida, apresentamos uma nova forma de forma eficiente transfecting MNs com plasmídeo de expressão usando magnetofection. Finalmente, ilustramos como corrigir e delgados primário que MNS. usando mutações de Neurofilamento que causam a doença de Charcot-Marie-Tooth tipo 2, este protocolo demonstra uma abordagem qualitativa para expressar proteínas de interesse e estudar o seu envolvimento em Crescimento de MN, manutenção e sobrevivência.

Depois de 24 horas na cultura, motoneurônios (MNs) já devem mostrar significativo crescimento axonal (pelo menos 6 vezes mais do que o tamanho da soma). Nos dias seguintes, axônios devem continuar a crescer e exibir ramificação (Figura 2). Vai haver diferentes morfologias devido às especificidades do subtipo. Por exemplo, coluna mediana MNs que inervam músculos axiais têm axônios mais curtos e mais ramificados do que a coluna lateral motor MNs que in...

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Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

O objetivo desta técnica é preparar uma cultura altamente enriquecida de motoneurônios primários (MNs) de murino da medula espinhal. Para avaliar as consequências das mutações causadoras de doenças MN, descrevemos aqui o isolamento destes isolados MNs e seu transfeccao por magnetofection.

Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Este método pode ajudar a abordar questões-chave na neurobiologia, como polaridade do neurônio motor, orientação do axônio, tráfico de axônio e mecanismos neurodegenerativos. A principal vantagem desta técnica é obter uma cultura de neurônio motor altamente enriquecida enquanto tomamos para expressar nossa proteína de knockdown por afeto minucioso. Para iniciar este procedimento, coloque um embrião em um prato de mídia de dissecção codificada com silício.Sob o microscópio, segure o embrião com o abdômen contra o silício com fórceps. Com o segundo par de fórceps, insira uma das pontas no canal central da medula espinhal rostrad. Em seguida, feche os fórceps para rasgar ligeiramente o tecido dorsal.Repita esta operação para o lado connell até que toda a medula espinhal seja aberta. Em seguida, posicione o embrião de modo que a medula espinhal aberta seja contra o silício. Posteriormente, despreze a parte rostrad da medula espinhal do corpo.Belisque a parte rostrad da medula espinhal, e puxe o embrião pela cabeça para extrair a medula espinhal. Retire cuidadosamente quaisquer meninges e DRGs restantes ainda ligados à medula espinhal. Achate a medula espinhal no silício e usando um bisturi, remova a metade dorsal da cordel cortando ao longo do meio de cada lado.Corte a parte do meio em dez pedaços, e transfira-as para um novo tubo. Para preparar a suspensão das células das medulas espinhais, colete as peças da medula espinhal na parte inferior do tubo. Substitua o HBSS por um mililitro de Ham F-10 médio e adicione dez microliters de trippsina.Incubar o tubo por dez minutos a 37 graus Celsius. Para parar a digestão enzimática, transfira os fragmentos para um novo tubo de 15 mililitros, contendo 800 microliters de meio L-15 completo, 100 microliters de 4%BSA e 100 microliters de DNAs e titulação, duas vezes. Deixe os fragmentos se contentarem por dois minutos antes de coletar o supernatante em um tubo fresco de 15 mililitros.Adicione suavemente dois mililitros de 4%BSA na parte inferior do tubo supernante. Centro fundir-o em 470 x gravidade por 5 minutos. Após 5 minutos, remova o supernasce e suspenda a paleta celular com 2 mililitros de meio L-15 completo.Para enriquecimento de motoneuron, divida a suspensão celular em dois tubos de 15 mililitros. Em seguida, adicione dois mililitros de meio L-15 PH a cada tubo. Se começar com seis embriões, use o equivalente a três embriões por tubo, e três mililitros de médio.Adicione lentamente 2 mililitros de solução de gradiência de densidade, ao fundo de cada tubo para obter uma interface afiada. Em seguida, centro fundi-lo em 830 x gravidade por 15 minutos em temperatura ambiente. Após esta etapa, as pequenas células devem estar na parte inferior do tubo, enquanto as grandes células - como o motoneuron - devem estar na solução de gradiente de densidade/interface média.Asperae 1 a 2 mililitros das células na interface e transferi-los para um tubo fresco de 15 mililitros. Ajuste o volume para dez mililitros com meio L-15 PH. Posteriormente, adicione dois mililitros da almofada 4%BSA ao fundo dos dois tubos.E o centro fusível a 470 x gravidade por 5 minutos em temperatura ambiente. Após 5 minutos, remova o supernasce e suspenda a paleta e 3 mililitros de meio L-15 completo. Repita a centrífuga a 470 x gravidade por 5 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, remova o supernatante e suspenda novamente a paleta celular e dois mililitros de meio de cultura completa. Para cultivar neurônios motores, dilui-os para 5.000-10.000 células em 500 microliters de cultura média por poço em uma placa de 24 poços. Em seguida, remova a solução de laminás com a ponta de tubulação P-1.000.Transfira imediatamente os neurônios motores diluídos em meio de cultura. às placas de codificação para evitar a secagem. Para preparar o DNA, suspenda 1 micrograma de DNA em 50 microliters do meio de cultura neuronal.E vórtice por 5 segundos. Para preparar o tubo B, suspenda 1,5 microliters de contas em 50 microliters de meio de cultura neuronal. Adicione 50 microliters de solução de contas a 50 microliters de solução de DNA e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.Durante esta incubação, retire 100 microliters de meio cultural do poço que será transfeinado. Posteriormente, transfira 100 microliters da mistura de contas de DNA para cada poço. E incubar a placa de 24 poços, 20-30 minutos na placa magnética a 37 graus Celsius.Mostrado aqui, é a morfologia do neurônio modem revelada pela posição de cadeia pesada de neurofilamento não fosfoilado endógeno após quatro dias de cultura. Nestas imagens, mostram a morfologia do neurônio modem após quatro dias in vitro e transfeccionado para o gene trans EGFP por magnetofecção no segundo dia. Os neurônios do lema foram contra-manchados com o marcador SMI-32 ou o marcador pan-neuro TUJ-1 e as setas indicam a soma dos neurônios.Estas são suas imagens confocais de neurônios motores magneto fected, expressando construções egfp nefh mutantes ou mutantes e manchadas para seu marcador autofágico LC-3B. Setas mostram os agregados mutantes de proteína EGFP NEFH que também são positivos LC-3B Após este procedimento, montoholda curcha pode ser analisada por microscopia de vídeo para visualizar o tráfico de axônio e adicionar alguma orientação. Após seu desenvolvimento inicial para abordar questões fundamentais na biologia neural, essa técnica também se mostra uma poderosa ferramenta para explorar mecanismos fisiopológicos que implicam o espectro de distúrbios motoneuron, como doença da síndrome do choque tóxico, esclerose lateral trófica samuel ou atrofia muscular espinhal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Detecção de placas neuríticas no rato da doença de Alzheimer Modelo

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectina baseado em isolamento e cultura de motoneurônios embrionárias de rato

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modelagem de Cancerous Neural Invasion: o gânglio Modelo de raiz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...