Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить «Ассоциация le développement de la neurogénétique» доктор Жакье стипендий и AFM-Телетон за его поддержку через MyoNeurAlp стратегического плана. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Крис Хендерсон, д-р Уильям Camu, доктор Brigitte Pettmann, Raoul Седрик д-р и д-р Георг Haase, кто участвовал в развитии и совершенствовании техники и распространения их знаний.

Все процедуры с участием животных были приняты этического комитета учреждения.
1. решение подготовка
<ol><li>Подготовка 10 мл 4% BSA dialyzed в L-15 среде.<ol>
<li>Альбумина bovine сыворотки порошок на 4% (w/v) растворяют в 10 мл L-15 среды.</li>
		<li>Добавьте решение в 20 мл диализа кассету с 20 кДа отсе?...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

Одним из критических точек в этот протокол является, что эмбрионов мыши разделяются на точное время окна во время разработки (E12.5), чтобы оптимизировать количество МНБ, полученные в конце. Кроме того для оптимальной урожайности, вскрытие должно выполняться утром или в начале второй поло...

Нервно-мышечные заболевания охватывают разнообразные клинически и генетически различных патологий, которые характеризуются изменения мышц и нервной системы. Из-за достижения в области технологий виртуализации, сотни генов, ответственных за эти редкие заболевания были выявлены в ходе последнего десятилетия (список доступных в центре нейромышечные болезнь, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Разнообразие выявленных мутаций указывает, что различные мутации одного гена может привести к разному фенотипы и болезней1,2,3 и что мутации в различных генов может производить аналогичные фенотипов 4 , 5. в этом контексте, являются усилия по развитию сотовой модели, которые могут стать мощные инструменты для анализа последствий мутации и патологических механизмов.
Позвоночника MNs имеют большие СОСМ, расположенный в вентральной рогов спинного мозга, длинные аксоны форме скелетных мышечных волокон, и позволяют добровольных движений через освобождение ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях. Так как MNs страдают от нервно-мышечных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб (CMT), и спинальной мышечной атрофии, д-р Хендерсон и коллеги разработали первый протокол6 , что позволило для выращивания в пробирке позвоночника MNs и открытие нейротрофических факторов GDNF7 (глиальных клеток производных нейротрофических факторов). Технические усовершенствования тех пор позволило для более точной очистки позвоночника MNs и их подтипы, использование СУИМ8, но обогащения градиент плотности остается мощным и широко используется в лабораториях, в настоящее время работает с основной позвоночника МНБ 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Впоследствии, это также возможно для получения более высокого класса очистки MN через immunopanning, воспользовавшись поверхности маркер p75(НТР)15,16,17.
Спинной мозг содержит различные подтипы шейного, грудного и поясничного отдела МНБ, а также средний и боковые мотор столбцы, которые отличаются среди их расположение в передней рога на оси dorso вентральной и среди целей они иннервируют8, 18. основной MN культур можно восстановить все эти подтипы MN в физиологических пропорциях. Основным ограничением этой методики является низкое количество МНБ, полученные в конце процедуры; в самом деле можно ожидать, чтобы получить около 105 MNs из шести эмбрионов, которая подходит для микроскопии, но ограничения для биохимии экспериментов. Для выполнения экспериментов с более стандартизированной подтипы и обильные MNs (> 106 клеток), эмбриональных стволовых клеток, полученных MNs следует рассматривать18.
Трансфекция диких тип/мутант трансгенов или эндогенных генов нокдаун в первичной MNs является быстрый и полезный инструмент для расшифровки выкидышей пути, особенно когда мышь модели недоступны. Magnetofection является методика transfecting первичной нейронов, похож на липофекция без соответствующих нейротоксичности. Кроме того transfection может выполняться на зрелых нейронов после нескольких дней в пробирке, в отличие от методов, основанных на электропорации9. Однако один из недостатков этого метода является бисер привязать нуклеиновых кислот в культуре, вызывая шум в маркировке DAPI. Вирусная инфекция, вероятно, наиболее эффективным методом для transfecting МНС; Однако magnetofection не требует определенных процедур обеспечения безопасности, необходимые для вирусных производства и клеточных инфекции.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Нейродегенеративные мотонейронов спинного мозга (MNs) причастны широкого спектра неврологических расстройств, включая боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб и спинальной мышечной атрофии, которые все связаны с мышечной атрофии. Основной культуры позвоночника МНБ использовали широко продемонстрировать участие конкретных генов в таких заболеваний и характеризуют сотовой последствия их мутаций. Эта культура модели первичной MN протокол производным от семенных работы Хендерсон и коллег более двадцати лет назад. Во-первых мы подробно метод рассечения передней рогах спинного мозга от зародыша мыши и изолировать MNs из соседних клеток, с использованием градиента плотности. Затем мы представляем новый способ эффективно transfecting MNs с плазмид выражение, с помощью magnetofection. Наконец мы показываем, как исправить и имунноконтраст первичной MNs. Использование neurofilament мутации, которые вызывают болезнь Шарко-Мари-зуб типа 2, этот протокол свидетельствует качественный подход к выражением протеинов интереса и изучение их участие в MN роста, техническое обслуживание и выживания.

После 24 часов в культуре мотонейронов (MNs) следует уже показывают значительный рост аксональное (по крайней мере 6 раз больше, чем размер сома). В последующие дни аксоны следует продолжать расти и отображения ветвления (рис. 2). Будут существовать различны...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Цель этой методики – подготовить высокообогащенного культуры первичной мотонейронов (MNs) из мышиных спинного мозга. Чтобы оценить последствия мутации, вызывая заболевания MN, мы опишем здесь изоляции эти изолированные MNs и их transfection magnetofection.

Моделирование болезнь Шарко Мари зуб в пробирке Transfecting мышь первичной мотонейронов

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Этот метод может помочь решить ключевые вопросы в нейробиологии, такие как полярность моторных нейронов, руководство аксоном, торговля аксоном и нейродегенеративные механизмы. Основным преимуществом этой техники является получение высокообогащенного моторного нейрона культуры в то время как мы принимаем, чтобы выразить наш нокдаун белка поминутной привязанности. Чтобы начать эту процедуру, поместите один эмбрион в блюдо вскрытия сми, закодированных с кремнием.Под микроскопом держите эмбрион с животом против кремния с помощью типсов. Со второй парой типсов вставьте один из кончиков в центральный канал ростовского спинного мозга. Затем закройте типсы, чтобы слегка разорвать спинную ткань.Повторите эту операцию в сторону коннелла до тех пор, пока весь спинной мозг не будет открыт. Далее, положение эмбриона так, что открытый спинной мозг против кремния. Впоследствии отсоедините рострадную часть спинного мозга от тела.Pinch рострад часть спинного мозга, и тянуть эмбрион за голову, чтобы извлечь спинной мозг. Тщательно вытащить все оставшиеся околивания и DRGs по-прежнему прилагается к спинному мозгу. Сгладить спинной мозг на кремнии и с помощью скальпеля, удалить спинную половину шнура, разрезая вдоль середины каждой стороны.Разрежьте среднюю часть на десять частей и перенесите их в новую трубку. Для подготовки спинного мозга клеточной подвески, собирать части спинного мозга в нижней части трубки. Замените HBSS на один миллилитр среднего Хам F-10 и добавьте десять микролитров трипсина.Инкубировать трубку в течение десяти минут при 37 градусах по Цельсию. Чтобы остановить энзиматическое пищеварение, перенесите фрагменты в новую 15-миллилитровую трубку, содержащую 800 микролитров полной среды L-15, 100 микролитров 4%BSA и 100 микролитров ДНК и титрата, дважды. Пусть фрагменты оседают в течение двух минут, прежде чем собирать супернатант в свежей 15 миллилитровой трубке.Аккуратно добавьте два миллилитров 4%BSA в нижней части супернатантной трубки. Центр сливает его при 470 x гравитации в течение 5 минут. Через 5 минут снимите супернатант и повторно приостановив клеточный поддон с 2 миллилитров полной L-15 среды.Для обогащения мотонейрона разделите подвеску клетки на две 15 миллилитровые трубки. Затем добавьте два миллилитров L-15 PH среды к каждой трубке. Если начать с шести эмбрионов, используйте эквивалент трех эмбрионов на трубку, и три миллилитров среднего.Медленно добавьте 2 миллилитров раствора градиентности плотности, в нижней части каждой трубки, чтобы получить острый интерфейс. Далее, центр предохранитель его при 830 х тяжести в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого шага, небольшие клетки должны быть в нижней части трубки, в то время как большие клетки, такие как мотонейрон-должны быть на плотность градиентного решения / среднего интерфейса.Asperae от 1 до 2 миллилитров клеток на интерфейсе и передать их в свежей 15 миллилитров трубки. Отрегулируйте громкость до десяти миллилитров со средним L-15 PH. Затем добавьте два миллилитров подушки 4%BSA к нижней части двух трубок.И центр предохранитель при 470 х тяжести в течение 5 минут при комнатной температуре. Через 5 минут снимите супернатант и повторно приостановив поддон и 3 миллилитров полного L-15 среднего. Повторите центрифугат при температуре 470 x в течение 5 минут при комнатной температуре.Затем снимите супернатант и повторно приостановив поддон клетки и два миллилитров полной культуры среды. Для культуры моторных нейронов, разбавить их до 5000-10000 клеток в 500 микролитров среды культуры на колодец в 24 хорошо пластины. Затем снимите раствор ламины с помощью наконечника трубы P-1, 000.Немедленно перенесите моторные нейроны, разбавленные в культурной среде. на кодирующие пластины, чтобы избежать высыхания. Для подготовки ДНК повторно приостанавливаем 1 микрограмм ДНК в 50 микролитров нейронной культуры среды.И вихрь в течение 5 секунд. Чтобы подготовить трубку B, повторно приостанавливать 1,5 микролитров бисера в 50 микролитров нейронной культуры среды. Добавьте 50 микролитров раствора шарика в 50 микролитров раствора ДНК и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре.Во время этой инкубации вывести из колодец 100 микролитров культурной среды, которые будут трансфицированы. Впоследствии перенесите 100 микролитров смеси шарика ДНК в каждую колодец. И инкубировать 24 хорошо пластины, 20-30 минут на магнитной пластине при 37 градусов по Цельсию.Показано здесь, является модем нейрон морфологии показали, стоя эндогенных не фосфорилированных нейрофиламент тяжелой цепи после четырех дней культуры. На этих снимках показана модемная нейронная морфология после четырех дней в пробирке и трансфицирована для EGFP транс-гена магнитофекцией на второй день. Девиз нейроны были противо запятнаны маркером SMI-32 или пан-нейро маркер TUJ-1 и стрелки указывают на сому нейронов.Это их конфокальные изображения магнито-fected моторных нейронов, выражают дикий тип или мутант EGFP NEFH конструкций и окрашенных для их аутофагический маркер LC-3B. Стрелки показывают мутант EGFP NEFH белковые агрегаты, которые также ЯВЛЯЮТСЯ LC-3B положительным После этой процедуры, montoholda curcha могут быть проанализированы с помощью видео микроскопии, чтобы визуализировать торговлю аксоном и добавить некоторые рекомендации. После его первоначального развития для решения фундаментальных вопросов в нейронной биологии, этот метод также оказаться мощным инструментом для изучения физио патологических механизмов, связанных спектр мотонейронов расстройств, таких как токсическое заболевание шокового синдрома, Самуэль трофического бокового склероза, или спинальной мышечной атрофии.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Обнаружение Neuritic бляшки при болезни Модель мыши Альцгеймера

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Лектин изоляции, основанные на культуре и мышь мотонейронов Эмбриональные

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Обнаружение микрорегиональном Гипоксия в мышь коры головного мозга на два фотона изображений эндогенной флуоресценции NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Экстракорпоральное моделирование раковой Neural вторжение: Спинной ганглий корень модели

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Моделирования нейронов смерти и дегенерации в мышь первичной мозжечковой гранул нейронов

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Характеристика и изоляция первичной микроглии мыши по плотности градиентного центрифугирования

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Нейрональная дифференциация от мыши эмбриональных стволовых клеток in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Моделирование инсульта у мышей: очаговые поражения коры при фототромбозе

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...