Name: modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Vi vill tacka de ”Association pour le développement de la neurogénétique” för Dr. Jacquier's fellowship och AFM-Telethon för dess stöd genom MyoNeurAlp strategisk plan. Vi vill också tacka Dr Chris Henderson, Dr William Camu, Dr Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul och Dr Georg Haase, som deltog i utveckla och förbättra tekniken och sprida sin kunskap.

Alla förfaranden som involverar djur godkändes av den etiska kommittén till institutionen.
1. lösningen förberedelse
<ol><li>Förbereda 10 mL 4% BSA dialyseras i l-15 medium.<ol>
<li>Lös bovint serumalbumin pulver 4% (w/v) i 10 mL av l-15 medium.</li>
		<li>Lägga till lösningen i en 20 mL dialys kassett med en 20 kDa cut-off. Dialyze mot 500 mL l-15 medium i 3 dagar under agitation vid 4 ° C. Ändra det l-15-mediet varje dag.</li>
		<li>Filtrera lösningen genom ett 0,22 µm membran...

<ol>
	<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+VCP+causes+Charcot-Marie-Tooth+Type+2+disease.">A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease.</a> Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).</li><li>Johnson, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+reveals+VCP+mutations+as+a+cause+of+familial+ALS.">Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS.</a> Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).</li><li>Watts, G. D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+myopathy+associated+with+Paget+disease+of+bone+and+frontotemporal+dementia+is+caused+by+mutant+valosin-containing+protein.">Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein.</a> Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).</li><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+ALS:+from+genes+to+mechanism.">Decoding ALS: from genes to mechanism.</a> Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).</li><li>Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+embryonic+motoneurons.">Purified embryonic motoneurons.</a> Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).</li><li>Henderson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDNF:+a+potent+survival+factor+for+motoneurons+present+in+peripheral+nerve+and+muscle.">GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.</a> Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alsin/Rac1+signaling+controls+survival+and+growth+of+spinal+motoneurons.">Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons.</a> Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).</li><li>Raoul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+activation+in+presymptomatic+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+mice+of+a+feedback+loop+involving+Fas,+Daxx,+and+FasL.">Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).</li><li>Madji Hounoum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wildtype+motoneurons,+ALS-Linked+SOD1+mutation+and+glutamate+profoundly+modify+astrocyte+metabolism+and+lactate+shuttling.">Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling.</a> Glia. 65 (4), 592-605 (2017).</li><li>Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Bioenergetic+Dysfunction+Is+Associated+with+Synaptic+Alterations+in+Mutant+SOD1+Motor+Neurons.">Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).</li><li>Jacquier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+amyloidogenic+elements+in+mutant+NEFH+causing+Charcot-Marie-Tooth+2+trigger+aggresome+formation+and+neuronal+death.">Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).</li><li>Aebischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN&#947;+triggers+a+LIGHT-dependent+selective+death+of+motoneurons+contributing+to+the+non-cell-autonomous+effects+of+mutant+SOD1.">IFN&#947; triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1.</a> Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).</li><li>Wiese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+enrichment+of+embryonic+mouse+motoneurons+from+the+lumbar+spinal+cord+of+individual+mouse+embryos.">Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos.</a> Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).</li><li>Camu, W., Henderson, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+embryonic+rat+motoneurons+by+panning+on+a+monoclonal+antibody+to+the+low-affinity+NGF+receptor.">Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor.</a> Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).</li><li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-based+Isolation+and+Culture+of+Mouse+Embryonic+Motoneurons.">Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Francius, C., Clotman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+spinal+motor+neuron+diversity:+a+long+quest+for+neuronal+identity.">Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons.">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li></ol>

En av de kritiska punkterna i detta protokoll är att musembryon är dissekeras på en exakt tidsfönster under utveckling (E12.5) för att optimera mängden MNs erhålls vid slutet. Dessutom för optimal avkastning, bör dissektion utföras på morgonen eller tidigt på eftermiddagen. Innan E12.5 (t.ex. på E11.5) är dissektion svårt, särskilt när det gäller eliminering av hjärnhinnorna. Efter E12.5 sjunker antalet erhållna MNs. För att styra det embryo utvecklingsstadiet, är vuxna honor och hanar för...

Neuromuskulära sjukdomar omfattar en mängd kliniskt och genetiskt distinkta patologier som kännetecknas av förändringen av muskler och/eller nervsystemet. På grund av framsteg inom sekvensering teknik, hundratals gener ansvariga för dessa sällsynta sjukdomar har identifierats under det senaste decenniet (lista finns på det Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Olika identifierade mutationer indikerar att olika mutationer i en gen kan orsaka olika fenotyper och sjukdomar1,2,3 och att mutationer i olika gener kan producera liknande fenotyper 4 , 5. i detta sammanhang finns det insatser för att utveckla cellular-modeller som kan bli kraftfulla verktyg för att analysera mutation konsekvenser och patologiska mekanismer.
Spinal MNs har stora somas ligger i ventrala hornsna av ryggmärgen, bildar långa axoner inrikta skeletala muskelfibrer och möjliggöra frivilliga rörelser genom frisättning av acetylkolin i neuromuskulära korsningar. Eftersom MNs påverkas av neuromuskulära sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros, utvecklat Charcot-Marie-Tooth sjukdom (CMT), och spinal muskelatrofi, Dr Henderson och kollegor det första protokoll6 som tillåtna för odling av in vitro- spinal MNs och upptäckten av neurotrofa faktor GDNF7 (glial cell härledd neurotrofisk faktor). Tekniska förbättringar sedan dess har tillåtit för exaktare rening av spinal MNs och deras undertyper som använder FACS8, men anrikning av täthetlutningen förblir kraftfulla och används i laboratorier som arbetar med primära spinal MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. därefter är det också möjligt att erhålla betyget högre MN rening genom immunopanning genom att utnyttja ytan markör p75(NTR)15,16,17.
Ryggmärgen innehåller olika subtyper av cervix, bröstkorg och ryggradens MNs, liksom median och laterala motor kolumner som skiljer sig åt mellan deras läge i främre horn på en dorso-ventrala axel och bland målen innerverar de8, 18. primära MN kulturer kan återställa alla dessa MN undertyper i fysiologiska proportioner. Den största begränsningen av denna teknik är det låga antalet MNs erhålls vid slutet av förfarandet. i själva verket kan det förväntas få cirka 105 MNs från sex embryon, som passar för mikroskopi men begränsande för biokemi experiment. Att utföra experiment med mer standardiserade subtyper och riklig MNs (> 106 celler), embryonala stamceller-derived MNs övervägas18.
Transfection wild-type/mutant transgener eller knockdown endogena gener till primära MNs är ett snabbt och användbart verktyg för att dechiffrera physiopathological vägar, särskilt när musmodeller är inte tillgängliga. Magnetofection är en teknik för transfecting primära nervceller, liknar lipofection utan den relaterade neurotoxicitet. Transfection kan dessutom utföras på mogna nervceller efter flera dagar i vitro, till skillnad från tekniker som bygger på elektroporation9. En nackdel med denna teknik är dock att pärlorna binder nukleinsyror i kultur, orsakar buller i DAPI märkning. Virusinfektioner är sannolikt den mest effektiva tekniken för transfecting MNs; magnetofection kräver dock inte vissa säkerhetsrutiner som krävs för viral produktion och cellulära infektion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone dissection dish</td>
			<td>Living systems instrumentation</td>
			<td>DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td>Sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round coverslip</td>
			<td>NeuVitro, Knittel glass</td>
			<td>GG-12-Pre</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide a Lyzer cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>66030</td>
			<td>20,000 MWCO ; 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP Sterile Syringe Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>167063</td>
			<td>Nunclon Delta treated plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>#5 forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>14060-10</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10035-20</td>
			<td>curved blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>micro-knife scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>663102</td>
			<td>&#248; x h = 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL polypropylene tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>Watman</td>
			<td>1001125</td>
			<td>circle, 125 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass chamber slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154526</td>
			<td>4 chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCAGEN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#11160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and mediums</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium, no red phenol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-DL-Ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin 2.5%, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS w/o Ca Mg</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron cell culture medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582901</td>
			<td>Neurobasal Plus medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer 1 M</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradiant medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>supplement medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A3582801</td>
			<td>B-27 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline/streptomycine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno fluorescence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>X0515</td>
			<td>without Mg2+ Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Acetyl Transferase (CHAT)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>Ab144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>SMI-32P</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>40.2D6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.4D5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hb9</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>81.5C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta3 tubulin (Tuj1 clone)</td>
			<td>Biolegends</td>
			<td>801201</td>
			<td>IF at 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lc3b</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2775</td>
			<td>IF at 1/200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling charcot-marie-tooth disease in vitro by transfecting mouse primary motoneurons

Neurodegeneration av spinal motoneurons (MNs) är inblandad i ett stort spektrum av neurologiska sjukdomar inklusive ALS, Charcot-Marie-Tooth sjukdom och spinal muskelatrofi, som är alla associerade med muskelatrofi. Primära kulturer av spinal MNs har använts allmänt att demonstrera medverkan av specifika gener i sådana sjukdomar och karakterisera cellulära konsekvenserna av deras mutationer. Detta protokoll modeller en primär MN kultur härstammar från Henderson och kollegor nyskapande arbete mer än tjugo år sedan. Det första detalj vi en metod att dissekera de främre hornsna av ryggmärgen från en mus embryo och isolera MNs från angränsande celler med hjälp av en täthetlutning. Sedan, vi presenterar ett nytt sätt att effektivt transfecting MNs med uttrycket plasmider använder magnetofection. Slutligen, vi illustrera hur fixar och immunostain primära MNs. använda neurofilament mutationer som orsakar Charcot-Marie-Tooth sjukdom typ 2, detta protokoll visar en kvalitativ metod att uttrycka proteiner av intresse och studera deras deltagande i MN tillväxt, underhåll och överlevnad.

Efter 24 timmar i kulturen, bör motoneurons (MNs) visar redan betydande axonal tillväxt (minst 6 gånger längre än soma storlek). I de följande dagarna, bör axoner fortsätta att växa och Visa förgrening (figur 2). Det kommer att finnas olika morfologier på grund av subtyp särdrag. Exempelvis har medianvärdet kolumn MNs som innerverar axial musklerna kortare och mer förgrenade axoner än laterala motor kolumn MNs som innerverar lem muskler<sup cla...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons at JoVE.com

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Målet med denna teknik är att förbereda en höganrikat kultur av primära motoneurons (MNs) från murina ryggmärgen. För att utvärdera konsekvenserna av mutationer som orsakar MN sjukdomar, vi beskriver här isoleringen av dessa isolerade MNs och deras transfection av magnetofection.

Modellering Charcot-Marie-Tooth sjukdom In Vitro av Transfecting mus primära Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Denna metod kan bidra till att ta itu med viktiga frågor i neurobiologi, såsom motor neuron polaritet, axon vägledning, axon människohandel, och neurodegenerativa mekanismer. Den största fördelen med denna teknik är att få en högberikad motor neuron kultur medan vi tar för att uttrycka vår knockdown protein genom minut tillgivenhet. För att börja detta förfarande, placera ett embryo i en maträtt av dissektion media kodade med kisel.Under mikroskopet, håll embryot med buken mot kisel med tuppar. Med det andra paret av tärna, sätt in en av spetsarna i den centrala kanalen i rostrad ryggmärgen. Stäng sedan tivorna för att riva ryggvävnaden något.Upprepa denna operation mot connell sidan tills hela ryggmärgen öppnas. Därefter placerar embryot så att den öppna ryggmärgen är mot kisel. Därefter lossa rostrad delen av ryggmärgen från kroppen.Nyp rostrad delen av ryggmärgen, och dra embryot i huvudet för att extrahera ryggmärgen. Dra försiktigt bort eventuella återstående hjärnhinnor och DRGs fortfarande fäst vid ryggmärgen. Platta ryggmärgen på kisel och med hjälp av en skalpell, ta bort rygghalvan halvan av sladden genom att skära längs mitten av varje sida.Skär den mellersta delen i tio bitar, och överföra dem till ett nytt rör. För att förbereda ryggmärgen cell suspension, samla ryggmärgen bitar längst ner i röret. Ersätt HBSS med en milliliter av Ham F-10 medium och tillsätt tio mikroliter trypsin.Inkubera röret i tio minuter vid 37 grader Celsius. För att stoppa den enzymatiska matsmältningen, överför fragmenten till ett nytt 15 milliliterrör, som innehåller 800 mikroliter av komplett L-15 medium, 100 mikroliter av 4%BSA, och 100 mikroliter av DNAs och titrate, två gånger. Låt fragmenten nöja sig i två minuter innan du samlar supernatanten i ett färskt 15 milliliterrör.Tillsätt försiktigt två milliliter på 4%BSA i botten av supernatantröret. Centro säkring det på 470 x gravitation i 5 minuter. Efter 5 minuter, ta bort supernatanten och återuppstäng cellpallen med 2 milliliter av komplett L-15 medium.För motoneuronberikning, dela cellupphängningen i två 15 milliliterrör. Tillsätt sedan två milliliter L-15 PH medium till varje rör. Om du börjar med sex embryon, använd motsvarande tre embryon per rör, och tre milliliter medium.Tillsätt långsamt 2 milliliter av densitet gradience lösning, till botten av varje rör för att få ett skarpt gränssnitt. Därefter centro säkring det på 830 x gravitation i 15 minuter vid rumstemperatur. Efter detta steg bör små celler vara längst ner i röret, medan stora celler-såsom motoneuron-bör vara vid densitet gradient lösning / medium gränssnitt.Asperae 1 till 2 milliliter av cellerna vid gränssnittet och överföra dem till en färsk 15 milliliter rör. Justera volymen till tio milliliter med L-15 PH-medium. Därefter, tillsätt två milliliter av 4%BSA kudden till botten av de två rören.Och centro säkring vid 470 x gravitation i 5 minuter vid rumstemperatur. Efter 5 minuter, ta bort supernatanten och åter upphäva pallen och 3 milliliter av komplett L-15 medium. Upprepa centrifugatet vid 470 x gravitation i 5 minuter vid rumstemperatur.Ta sedan bort supernatanten och dra upp cellpallen på åter och två milliliter av komplett odlingsmedium. Att odla motoriska nervceller, späd dem till 5, 000-10, 000 celler i 500 mikroliter av kultur medium per brunn i en 24 väl platta. Ta sedan bort laminaelösningen med vid P-1, 000 pipet spets.Omedelbart överföra motor neuronerna utspädd i odlingsmedium. till kodningsplattorna för att undvika torkning. För att förbereda DNA, åter avbryta 1 mikrogram DNA i 50 mikroliter av neuronal odling medium.Och virvel i 5 sekunder. För att förbereda B-röret, åter avbryta 1,5 mikroliter av pärlor i 50 mikroliter av neuronal odling medium. Tillsätt 50 mikroliter av pärllösning till 50 mikroliter DNA-lösning och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.Under denna inkubation, dra tillbaka 100 mikroliter av odlingsmedium från brunnen som kommer att transfekteras. Därefter överför 100 mikroliter av DNA-pärlmixen till varje brunn. Och inkubera 24 brunnsplattan, 20-30 minuter på magnetplattan vid 37 grader Celsius.Visas här, är modemet neuron morfologi avslöjade genom att stå av endogena icke-fosforylerat neurofilament tung kedja efter fyra dagar av kultur. I dessa bilder, visa modemet neuron morfologi efter fyra dagar in vitro och transfected för EGFP transgen genom magnetofection på dag två. Motto nervceller var counter-färgade med markören SMI-32 eller pan-neuro markör TUJ-1 och pilarna anger soma av nervceller.Dessa är deras confocal bilder av magneto infekterade motor nervceller, uttrycker vild typ eller mutant EGFP NEFH konstruktioner och färgas för deras autofagisk markör LC-3B. Pilar visar mutanten EGFP NEFH protein aggregat som också är LC-3B positiva Efter detta förfarande, montoholda curcha kan analyseras av videomikroskopi för att visualisera axon trafficking och lägga till lite vägledning. Efter dess inledande utveckling att ta itu med grundläggande frågor i neural biologi, denna teknik också visa sig vara ett kraftfullt verktyg för att utforska physio patologiska mekanismer som involverar spektrumet av motoneuron störningar, såsom toxic shock syndrome disease, samuel trofisk lateral skleros, eller spinal muskulär atrofi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Upptäckt av Neuritic plack i Alzheimers sjukdom musmodell

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lektin-baserade isolering och odling av mus Embryonala Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detektion av Microregional hypoxi i mus Cerebral Cortex med två-foton Imaging av endogen NADH fluorescens

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

I vitro Modellering av cancer Neural Invasion: dorsala ganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Karakterisering och isolering av mus primära mikroglia täthet lutning centrifugering

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snabb och specifika immunmagnetisk isolering av mus primära oligodendrocyter

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal differentiering från mus embryonala stamceller in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Modelleringsslag hos möss: Fokala kortikala lesioner genom fotokrobtik

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...